La biosíntesis de colesterol modula la diferenciación en células de la cresta neural craneal murina - El lago de los cisnes Co., Ltd de Shijiazhuang

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7073 (2023) Citar este artículo

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Las células de la cresta neural craneal (cNCC) son una población de células embrionarias multipotentes que dan lugar a un conjunto diverso de tipos de células. Estas células son particularmente vulnerables a los estresores metabólicos externos, como lo demuestra la asociación entre la hiperglucemia materna y las malformaciones congénitas. Estábamos interesados en estudiar el efecto de varias concentraciones de glucosa y piruvato en el metabolismo, la migración y la diferenciación de cNCC utilizando un modelo de célula de cresta neural murina establecido (O9-1). Inesperadamente observamos un patrón de expresión génica que sugiere la inducción de la biosíntesis de colesterol en condiciones de agotamiento de glucosa en células O9-1. Además, demostramos que el tratamiento con dos inhibidores de la síntesis de colesterol diferentes interfirió con la migración y la diferenciación celular, inhibiendo la condrogénesis y mejorando la diferenciación de las células del músculo liso. Como la arhinia congénita (nariz externa ausente), una malformación causada por mutaciones en SMCHD1, parece representar, en parte, un defecto en cNCC, también nos interesó investigar los efectos de la disponibilidad de glucosa y colesterol en la expresión de Smchd1 en células O9-1. . La expresión de Smchd1 se indujo en condiciones de glucosa alta, mientras que los inhibidores de la síntesis de colesterol redujeron la expresión de Smchd1 durante la condrogénesis. Estos datos destacan un papel novedoso para la biosíntesis de colesterol en la fisiología de cNCC y demuestran que la variabilidad fenotípica humana en los portadores de la mutación SMCHD1 puede estar relacionada, en parte, con la sensibilidad de SMCHD1 a la dosis de glucosa o colesterol durante el desarrollo.

Las células de la cresta neural (NCC) son una población de células embrionarias transitorias derivadas del ectodermo que dan lugar a un conjunto diverso de tipos de células. Durante el desarrollo embrionario, los NCC migratorios atraviesan diversos entornos con nutrientes únicos y activación localizada de enzimas que pueden afectar su programación genética y fisiología1. Los estudios que examinan el efecto de las perturbaciones en la disponibilidad de sustrato muestran que la regulación espaciotemporal del desarrollo está impulsada en parte por cambios en el metabolismo2. Los cambios metabólicos en NCC se asocian temporalmente con, y de hecho pueden estimular, pasos críticos en la ontogenia de NCC, como la proliferación, la migración y la diferenciación3. Además, los NCC parecen ser particularmente vulnerables a factores estresantes metabólicos externos, siendo la hiperglucemia un buen ejemplo. La diabetes gestacional se asocia con un mayor riesgo de malformaciones congénitas que afectan los tejidos y órganos derivados de la NCC (p. ej., sistema cardiovascular, esquelético y nervioso central), lo que sugiere que la hiperglucemia materna es altamente tóxica para la NCC4,5,6,7. De hecho, los primeros estudios in vitro demostraron que las condiciones de cultivo con alto contenido de glucosa inhiben la proliferación y migración de cNCC de rata debido a la sobreproducción de especies reactivas de oxígeno8. Un trabajo más reciente en pollitos ha demostrado además que la exposición a niveles altos de glucosa aumenta la apoptosis y la autofagia mediada por ERK en el desarrollo de cNCC9 y suprime la diferenciación de células madre embrionarias en un linaje neuronal10. Sin embargo, no se han realizado estudios para determinar cómo la disponibilidad de nutrientes afecta la fisiología de los NCC utilizando la línea celular O9-1, una línea multipotente derivada de NCC embrionarios de ratón11.

Los defectos en la ontogenia, migración y/o diferenciación de NCC dan lugar a un conjunto de condiciones denominadas neurocristopatías. El síndrome de bosma arhinia microphthalmia (BAMS) es una malformación congénita grave extremadamente rara que parece reflejar un defecto primario del NCC12 craneal, las células de la placoda craneal13 o su interacción. BAMS consiste en la tríada clínica de arhinia (ausencia de nariz), defectos oculares e hipogonadismo14 y está causado por mutaciones en el gen Structural Maintenance of Chromosomes Flexible Hinge Domain-containing 1 (SMCHD1)15,16. Sin embargo, la presencia de penetrancia incompleta y expresividad variable en familias multiplex sugiere que otros factores en el útero pueden influir en la expresión o función de SMCHD1. Presumimos que la disponibilidad de nutrientes podría ser uno de esos factores. No se ha informado diabetes gestacional en embarazos BAMS, sin embargo, es probable que BAMS no se informe (< 100 casos informados en el siglo pasado15), las pautas para diagnosticar diabetes gestacional varían de un país a otro y se han vuelto más estrictas con el tiempo, y recientemente Se ha reconocido que la hiperglucemia materna se asocia linealmente con el riesgo perinatal sin un umbral obvio17. Por lo tanto, utilizando el sistema modelo O9-1, también investigamos el efecto de la disponibilidad de nutrientes en la expresión de Smchd1.

Presumimos que diferentes condiciones metabólicas afectarían la fisiología de cNCC. Estudiamos el efecto de 4 condiciones de cultivo: glucosa alta (HG = glucosa 25 mM, piruvato 1 mM), glucosa control (CG = glucosa 5,55 mM, piruvato 1 mM), sin glucosa (NG = glucosa 0 mM, piruvato 1 mM) , y sin glucosa con 2 × piruvato (NG2P = glucosa 0 mM, piruvato 2 mM). Si bien los protocolos de cultivo celular utilizan con frecuencia condiciones HG para maximizar la proliferación, se seleccionó la condición CG para representar mejor la fisiología del embrión en desarrollo18. La condición NG se eligió para determinar si cNCC podría usar sustratos metabólicos alternativos como el piruvato; el piruvato fue de particular interés dada su posición en la encrucijada de múltiples vías en el metabolismo del carbono y demostró funciones en la activación del genoma embrionario19 y la fisiología del NCC3,20,21.

Para determinar cómo las diferentes condiciones de glucosa (HG, CG, NG, NG2P) afectan la expresión génica en cNCC de ratón, se empleó un análisis de red de correlación de genes ponderados (WGCNA) para interpretar los datos de RNA-Seq. WGCNA construye redes de coexpresión de genes teniendo en cuenta los patrones de correlación entre los genes de las muestras22. A continuación, se utiliza la agrupación jerárquica para identificar módulos o redes de genes con una expresión génica altamente correlacionada. Luego, estos módulos pueden relacionarse con otros rasgos (aquí, la concentración de glucosa) e interrogarse para el enriquecimiento funcional. Los módulos de interés se seleccionan en función de la importancia media del gen, la pertenencia al módulo (conectividad genética dentro de un módulo), la relación con un rasgo o las vías biológicas. Para seleccionar módulos de interés, primero consideramos la fuerza de la membresía del módulo (conectividad> 0.6). Dado que nuestro diseño experimental incluía un gradiente de concentraciones de glucosa, elegimos explorar los dos módulos donde también había un gradiente lineal en el cambio de expresión de HG a CG a NG a NG2P. Se identificaron dieciséis módulos de genes coexpresados en diferentes condiciones de glucosa. En el módulo turquesa, la expresión génica disminuyó según las condiciones, mientras que en el módulo azul, la expresión génica aumentó según las condiciones (Fig. 1A, B, Tabla complementaria S1). El análisis de sobreenriquecimiento del modelo turquesa reveló vías asociadas con el ciclo celular y la reparación del ADN (Fig. S1 complementaria), mientras que el análisis del módulo azul reveló inesperadamente la biosíntesis de colesterol, el metabolismo de los esfingolípidos y los glucoesfingolípidos (Fig. 1C, Fig. S1 complementaria). La glucosa y los metabolitos derivados de la glucosa proporcionan materias primas para la síntesis del colesterol y regulan las enzimas biosintéticas y la captación del colesterol23. Por lo tanto, se esperaría que el agotamiento de la glucosa regule a la baja la biosíntesis de colesterol; sin embargo, los miembros de la vía de biosíntesis del colesterol, incluidos Hmgcr, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol, y Hmgcs1, que cataliza la producción de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA)24,25, mostraron una mayor expresión bajo Condiciones NG y NG2P en comparación con HG (Fig. 1D). La proteína de unión a emopamilo (Ebp), que desempeña un papel clave en la etapa final de la biosíntesis del colesterol, también se reguló positivamente en las condiciones CG frente a HG (Fig. 1D). A continuación, medimos directamente los niveles de colesterol libre, colesterol esterificado y colesterol total (es decir, la suma de colesterol libre más esterificado) en las diversas condiciones de cultivo de glucosa. No se observaron diferencias significativas en el colesterol libre o total, mientras que hubo un colesterol esterificado más bajo en HG en comparación con las condiciones CG, NG y NG2P (Fig. 2A-C).

La disponibilidad de glucosa afecta el transcriptoma cNCC. (A) Valores de correlación de Pearson entre el nivel de expresión génica del módulo y la disponibilidad del sustrato; glucosa alta (HG = glucosa 25 mM, piruvato 1 mM), glucosa de control (CG = glucosa 5,55 mM, piruvato 1 mM), sin glucosa (NG = glucosa 0 mM, piruvato 1 mM) y sin glucosa con 2 × piruvato ( NG2P = glucosa 0 mM, piruvato 2 mM) con valores p ajustados (entre paréntesis) se muestran en cada contenedor; correlación de 1 o -1 indica una fuerte relación positiva o negativa, respectivamente. (B) Los mapas de calor y los diagramas de barras muestran la expresión génica escalada y los valores propios de los módulos turquesa y azul. (C) Análisis de la vía de los genes del módulo azul filtrados para la pertenencia al módulo > 0,6. (D) Mapa de calor de los genes implicados en la biosíntesis del colesterol.

La disponibilidad de glucosa regula los niveles de colesterol esterificado en cNCC. Niveles de colesterol total, esterificado y libre normalizados a proteína en cNCC cultivados en condiciones HG, CG, NG y NG2P. n = 3 por grupo. Los valores se muestran como la media ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01.

Nos propusimos examinar la importancia de la biosíntesis del colesterol en la fisiología de cNCC mediante el uso de dos fármacos que son estructuralmente diferentes y que afectan la ruta biosintética del colesterol en diferentes puntos. Fatostatin es un inhibidor de la síntesis de colesterol de molécula pequeña que bloquea la activación de SREBP-1 y -2, reguladores maestros de la síntesis de colesterol y ácidos grasos26. La fluvastatina inhibe directamente la HMG-CoA reductasa, la enzima limitante de la biosíntesis del colesterol27. Ambos fármacos también se han utilizado para inhibir la síntesis de colesterol en el neuroblastoma, una neoplasia maligna derivada de NCC. Para identificar la concentración de trabajo ideal de fatostatina en las células O9-1, primero medimos los cambios en la expresión del gen de síntesis de colesterol y la viabilidad celular. Elegimos un rango de concentraciones (5 a 25 µM) en base a experimentos previos realizados en células embrionarias28. Identificamos concentraciones de fatostatina y fluvastatina que no eran tóxicas para cNCC a través del ensayo de viabilidad de células vivas Incucyte basado en la confluencia celular (Fig. 3A). La fatostatina redujo significativamente la viabilidad del cNCC de O9-1 a 25 µM. La fatostatina redujo drásticamente los niveles de ARNm de Srebf2, Hmgcr, Hmgcs1, Lss y Mvd a 10 µM y 25 µM después de 48 h de tratamiento (Fig. 3B). Con base en estos resultados, seleccionamos 10 μM como la concentración mínima que provocaría la inhibición de la síntesis de colesterol sin afectar la viabilidad celular para estudios adicionales. Para validar la supresión observada de la biosíntesis de colesterol por fatostatina y fluvastatina, medimos directamente los niveles de colesterol utilizando el ensayo Amplex Red en células O9-1 en condiciones HG, CG, NG y NG2P. En presencia de fatostatina 10 µM, los niveles de colesterol total y esterificado se redujeron significativamente en todas las condiciones de glucosa y los niveles de colesterol libre se redujeron en condiciones NG y NG2P (Fig. 3C). En presencia de fluvastatina 10 µM, los niveles de colesterol total fueron más bajos en GC y NG2P, los niveles de colesterol esterificado fueron más bajos solo en GC. Los niveles de colesterol libre se redujeron en HG, CG y NG2P después del tratamiento con fluvastatina. Por lo tanto, la fatostatina fue más potente en la supresión de los niveles de colesterol total y esterificado que la fluvastatina, presumiblemente porque, al bloquear la SREBP-2, tiene el potencial de afectar toda la vía biosintética del colesterol.

Inhibición de la síntesis de colesterol en O9-1 cNCC. (A) Viabilidad de O9-1 cNCC cultivada durante 48 h en presencia de fatostatina o fluvastatina a 5, 10 y 25 µM en comparación con las condiciones del vehículo ("0"). n = 3 por grupo. (B) Niveles de expresión génica de Srebf2, Hmgcr, Hmgcs, Lss, Mvd normalizados a niveles de 18S en células cultivadas en HG tratadas con 0 (vehículo), 5, 10 y 25 µM de fatostatina. (C) Niveles de colesterol total, esterificado y libre normalizados a proteína en cNCC cultivados en condiciones HG, CG, NG y NG2P en ausencia (vehículo) o presencia de 10 µM de fatostatina o fluvastatina. n = 3 por grupo. Los valores se muestran como la media ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

La muerte celular programada en cNCC es fundamental para el patrón/conformación craneofacial29. Se ha demostrado que la disponibilidad de glucosa, específicamente, los aumentos elevados de especies reactivas de oxígeno mediados por glucosa, influyen en la apoptosis de cNCC9. Además, los estudios han demostrado que tanto la fatostatina como la fluvastatina, un inhibidor directo de la HMG-CoA reductasa, poseen efectos apoptóticos30,31,32,33. Por lo tanto, estábamos interesados en examinar el efecto de los inhibidores del colesterol en la susceptibilidad de cNCC a la apoptosis en diferentes condiciones de glucosa. Como se esperaba, el aumento de la glucosa condujo a un aumento de ~ 20 veces en la apoptosis que alcanzó significación estadística en el último momento en ausencia de inhibidores de la síntesis de colesterol (Fig. 4A). El examen de la apoptosis en presencia de inhibidores de la síntesis de colesterol reveló que solo el tratamiento con fatostatina dio como resultado un aumento de la apoptosis (sin diferencias apreciables entre las condiciones de fluvastatina y vehículo), y su efecto fue independiente de la glucosa (Fig. 4B).

La regulación del metabolismo del colesterol mediada por glucosa puede desempeñar un papel en la muerte celular programada de cNCC. (A) La apoptosis en cNCC cultivada en condiciones HG, CG, NG y NG2P representada en función de la disponibilidad de glucosa para examinar los efectos de la inhibición de la síntesis de colesterol, se midió mediante el ensayo de apoptosis Casp3/7 de células vivas Incucyte. n = 6 pozos/condición; Se recolectaron múltiples imágenes por pocillo para 3d. (B), la apoptosis en cNCC cultivada en condiciones HG, CG, NG y NG2P en ausencia (vehículo) o presencia de 10 μM de fatostatina o fluvastatina se midió mediante el ensayo de apoptosis Casp3/7 de células vivas Incucyte. Cada barra representa medias ± SD. **** p < 0,0001.

Como la migración desde el tubo neural es una parte crítica de la ontogenia de cNCC, preguntamos si el bloqueo de la síntesis de colesterol afecta la migración de cNCC (Fig. 5A, B). La migración se midió a través de un ensayo convencional de herida por rascado en el que se permite que las células alcancen la confluencia total antes de que se introduzca una herida en la monocapa celular para inducir la polarización celular y la migración al espacio resultante (Fig. S2 complementaria). El ancho de la herida fue significativamente mayor en presencia de fatostatina en condiciones de CG y NG, en consonancia con la disminución de la capacidad migratoria. El tratamiento con fluvastatina también resultó en un aumento del ancho de la herida en comparación con el tratamiento con vehículo en GC y NG; sin embargo, este efecto alcanzó significación estadística solo en la condición de GC. La concentración de glucosa sola no afectó la migración de cNCC de O9-1 (Fig. 5B).

La biosíntesis de colesterol juega un papel en la migración de cNCC. (A) La migración celular de cNCC cultivada en condiciones HG, CG, NG y NG2P en ausencia (vehículo) o presencia de fatostatina o fluvastatina 10 μM se examinó en un analizador de células vivas Incucyte a través de un ensayo de herida por rascado. n = 4 por grupo; Se recogieron múltiples imágenes por pocillo cada hora durante 36 h. El panel (B) demuestra los mismos datos en ausencia de inhibidores de la síntesis de colesterol para resaltar el efecto de la disponibilidad de glucosa. Cada punto de datos representa medias ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Las cNCC son células madre multipotentes que dan lugar a varios tipos de células durante el desarrollo, incluidas las neuronas craneales, la glía, las células del músculo liso, los osteoblastos y los condrocitos30,34,35. Además, las mutaciones en los genes de la vía de síntesis del colesterol se han asociado con dismorfia facial que resulta de la modulación aberrante de la diferenciación de condrocitos mediada por señalización WNT43,44.

Para evaluar si los niveles de colesterol afectan el potencial de cNCC para diferenciarse en condrocitos36,37, realizamos un ensayo de condrogénesis con células O9-1 en condiciones de HG y CG, ya que estábamos particularmente interesados en comparar suprafisiológicos (similares a la hiperglucemia) y fisiológicos (euglucémicos). condiciones (Fig. 6). Las células O9-1 se cultivaron en medio de diferenciación osteogénica durante 3 días antes del cultivo en medio de diferenciación condrogénica durante 7 días, como se describió previamente35. El tratamiento con inhibidores de la síntesis de colesterol 10 µM a lo largo del proceso de diferenciación de 10 días dio como resultado una confluencia celular dispar en las diferentes condiciones de glucosa; por lo tanto, todos los experimentos de diferenciación se realizaron en presencia de fatostatina y fluvastatina 5 µM. La cuantificación del azul alcián, utilizado para teñir específicamente los polisacáridos ácidos presentes en el cartílago, mostró que la fatostatina redujo significativamente la diferenciación en condrocitos tanto en condiciones de HG como de CG, mientras que la fluvastatina redujo la diferenciación en la condición de CG (Fig. 6B). Los niveles de colesterol total (medidos al final de la condrogénesis) reflejaron una tendencia similar: el colesterol disminuyó con el tratamiento con fatostatina tanto en condiciones de HG como de CG en comparación con el vehículo, mientras que el tratamiento con fluvastatina resultó en una disminución del colesterol solo en la condición de CG, lo que es consistente con un papel de colesterol en la condrogénesis (Fig. 6C).

La disminución de la síntesis de colesterol desplaza el destino terminal de cNCC lejos de la condrogénesis. (A) Tinción con azul alcián de cNCC cultivado en medio de condrogénesis en condiciones HG y CG en presencia de vehículo o fatostatina y fluvastatina 5 µM. Las barras de escala son de 50 µM. (B) Cuantificación espectrofotométrica de las imágenes del panel A (pocillos de muestra de 4 cm2, n = 5 por grupo). (C) Niveles de colesterol total normalizados a proteína en cNCC cultivados en medio de condrogénesis en las condiciones especificadas (n = 3 por grupo). Cada barra representa la media ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

También examinamos la capacidad de cNCC para diferenciarse en células de músculo liso en células O9-1 cultivadas en condiciones de HG y CG en ausencia o presencia de fatostatina y fluvastatina 5 μM (Fig. 7A). La cuantificación de la inmunofluorescencia de actina de músculo liso mostró que el bloqueo de la síntesis de colesterol mediante el tratamiento con fatostatina o fluvastatina aumentó significativamente la diferenciación en células de músculo liso tanto en condiciones de HG como de CG (Fig. 7B).

La inhibición de la síntesis de colesterol favorece los destinos terminales del músculo liso. (A) Inmunotinción de actina de músculo liso de cNCC cultivada en condiciones de HG y CG en presencia de vehículo, fatostatina y fluvastatina (5 µM). Las barras de escala son de 50 µM. (B) Cuantificación de la densidad de intensidad de fluorescencia/área de cNCC teñida con actina de músculo liso representada en el panel A. n = 5 fotogramas por grupo. Cada barra representa medias ± SD. ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Volviendo nuestra atención a SMCHD1, preguntamos si la concentración de glucosa sola y la inhibición de la síntesis de colesterol durante la condrogénesis podrían afectar la expresión de Smchd1 (Fig. 8A). El tratamiento con fatostatina disminuyó la expresión del ARNm de Smchd1 en las condiciones CG y HG, mientras que el tratamiento con fluvastatina afectó la expresión de Smchd1 solo en la condición CG. La concentración de glucosa durante la condrogénesis no afectó la expresión de Smchd1 (Fig. 8A). Sin embargo, al inicio del estudio, la expresión del ARNm de Smchd1 aumentó significativamente en HG en comparación con las condiciones CG, NG y NG2P (Fig. 8B) en células O9-1.

Los niveles altos de glucosa aumentan la expresión de Smchd1 en cNCC. (A), niveles de expresión del gen Smchd1 normalizados a niveles de β-actina en cNCC cultivados en medio de condrogénesis en las condiciones especificadas (n = 3 por grupo). (B), niveles de expresión génica normalizados de Smchd1 (obtenidos del estudio RNA-seq) en cNCC cultivados en HG, CG, NG y NG2P (n = 3 por grupo). Cada barra representa medias ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01.

Los NCC son una población de células progenitoras multipotentes embrionarias tempranas exclusivas de los vertebrados38. Surgen del ectodermo embrionario y experimentan una transición epitelial a mesenquimatosa a medida que se delaminan y migran por todo el cuerpo39, contribuyendo a una amplia variedad de estructuras que incluyen, entre otros, cartílago y hueso craneofacial, músculo liso, melanocitos, miofibroblastos, periférico/ neuronas entéricas y células gliales40. La amplia capacidad migratoria y multipotencia de NCC se combina con, y puede depender de, un nuevo cableado del metabolismo, que no solo sirve para satisfacer las demandas energéticas únicas de estas células, sino que también puede proporcionar metabolitos que modulan la transcripción de genes y, por lo tanto, influyen en la diferenciación. Sobre la base de estudios previos que apuntan a un papel central de la glucólisis en este proceso3,8,9,10,20,41,42,43,44, nos propusimos dilucidar cómo las perturbaciones en la disponibilidad de glucosa afectan la fisiología de cNCC. Nuestros datos de RNA-seq WGCNA y colesterol sugieren que en condiciones de glucosa elevada, como durante la diabetes gestacional, por ejemplo, se suprime la esterificación del colesterol.

Investigamos más a fondo la relevancia biológica de la síntesis de colesterol en procesos centrales para la función de cNCC. Logramos una regulación a la baja significativa de los genes biosintéticos del colesterol y los niveles celulares de colesterol a través de la inhibición farmacológica de la biosíntesis del colesterol sin comprometer la viabilidad celular. Observamos una disminución de la migración celular (aumento del ancho de la herida) tanto con fatostatina (condición CG y NG) como con fluvastatina (condición CG y tendencia con NG). Curiosamente, la inhibición de la síntesis de colesterol no alteró significativamente la migración de las células O9-1 cultivadas en condiciones de agotamiento de la glucosa cuando se complementó con 2 × piruvato. Aunque se ha demostrado previamente que se requiere un alto flujo glucolítico para una migración de NCC adecuada45, nuestros resultados también sugieren una interacción entre el piruvato y la regulación mediada por el colesterol de la migración de cNCC que justifica una mayor investigación. Finalmente, en presencia de fatostatina (condición CG y HG) y fluvastatina (solo condición CG), observamos una capacidad disminuida de cNCC para diferenciarse en condrocitos y un cambio hacia la formación de células de músculo liso. La interrupción de la biosíntesis del colesterol da como resultado una señalización defectuosa de Sonic-Hedgehog, que tiene funciones críticas en la proliferación y supervivencia de cNCC46,47. Además, se sabe que las balsas lipídicas ricas en colesterol regulan la señalización canónica de Wnt, que está involucrada en la proliferación celular y la determinación del destino celular durante el desarrollo embrionario48. De hecho, Castro et al. mostró que la inhibición de la síntesis de colesterol en el pez cebra condujo a defectos faciales que podrían ser rescatados por un agonista de Wnt37. La señalización de Wnt es importante tanto en la condrogénesis49 como en el desarrollo del músculo liso50. Por lo tanto, es posible que un cambio en la señalización de Wnt favorezca la diferenciación hacia un destino de músculo liso a expensas de los condrocitos. En conjunto, nuestros resultados complementan estudios previos36,37 y proporcionan evidencia adicional de que el colesterol intracelular puede ser una señal endógena importante que ayuda a dictar el destino de cNCC51.

No se han realizado estudios en NCC humanos para demostrar que son capaces de biosíntesis de colesterol, sin embargo, el perfil transcripcional de células agresivas de neuroblastoma humano y de ratón, una neoplasia maligna derivada de NCC, ha demostrado una mayor biosíntesis de colesterol impulsada por el elemento regulador de esterol del factor de transcripción. proteína de unión-2 (SREBP-2)26. También se han identificado gotitas de lípidos en NCC de tronco migratorio y posmigratorio en embriones de ratón E8.5–9.552, lo que indica un posible reservorio de colesterol. Además, el síndrome de Smith-Lemli-Opitz, una condición humana rara causada por un defecto en la 7-dehidrocolesterol reductasa, se asocia con características dismórficas que afectan la cabeza (p. ej., microcefalia), la cara (p. ej., paladar hendido) y las extremidades (p. ej., , poli o sindactilia), así como defectos cardíacos e intestinales (aganglionosis) que pueden reflejar en parte una función alterada del NCC53. Por último, estudios previos en peces cebra portadores de HMGCS y HMGCR mutantes, enzimas críticas en la ruta de biosíntesis del colesterol, identificaron malformaciones en el cartílago craneal debido a una diferenciación deficiente de NCC36,54, lo que es consistente con nuestros datos usando inhibidores de colesterol durante la condrogénesis en O9-1 cNCC.

Dada la variabilidad fenotípica en nuestra cohorte de arhinia y nuestro interés en los posibles modificadores ambientales que actúan en el útero, también nos interesaron los efectos de la disponibilidad de glucosa y colesterol en la expresión de Smchd1 durante la condrogénesis. Observamos que la expresión del ARNm de Smchd1 aumentó a niveles más altos de glucosa y fue menor al completarse la condrogénesis en presencia de fatostatina (HG y CG) y fluvastatina (CG). Por lo tanto, la expresión de Smchd1 parece ser sensible tanto a la disponibilidad de glucosa como al contenido de colesterol celular (durante la condrogénesis). Si las mutaciones de sentido erróneo de SMCHD1 humano de hecho actúan de manera de ganancia de función16, un aumento en la expresión de Smchd1 impulsado por un nivel más alto de glucosa posiblemente podría exacerbar el fenotipo, mientras que una disminución en la expresión durante la condrogénesis podría crear un fenotipo más leve (p. ej., hipoplasia nasal). o anosmia). También es concebible que una mujer, sin saberlo, pueda estar expuesta a estatinas de origen natural y fúngico durante el embarazo. Aunque las estatinas no se han relacionado definitivamente con los defectos congénitos55,56, la exposición a las estatinas en el útero podría alterar los efectos fenotípicos de una mutación SMCHD1 existente, lo que contribuye a la disminución de la actividad represiva mediada por SMCDH1 y la variabilidad en los fenotipos humanos entre los portadores de la mutación SMCHD115.

En general, nuestro estudio demuestra un papel crucial para una nueva modulación de la colesterogénesis mediada por glucosa que actúa como "guardián" de la fisiología y la función de cNCC, proporcionando señales metabólicas que influyen en la proliferación, migración y diferenciación celular. El colesterol juega un papel importante en la migración y diferenciación de células cNCC de ratón hacia un linaje condrogénico o miogénico, un importante proceso de modulación que se amortigua por concentraciones suprafisiológicas de glucosa como las observadas en la diabetes gestacional. También demostramos que la expresión del represor epigenético, Smchd1, es sensible a la glucosa (en medios O9-1) y a la dosis de colesterol durante la condrogénesis, lo que proporciona una confirmación adicional del vínculo entre el colesterol, la fisiología del cNCC y el desarrollo craneofacial. Se necesitan más estudios, incluso si la regulación positiva del colesterol puede o no rescatar estos fenotipos celulares, para delinear los fundamentos mecánicos de esta regulación del comportamiento cNCC mediada por el colesterol en condiciones de disponibilidad variable de glucosa.

Las células O9-1 fueron un regalo de K. Shpargel (UNC-Chapel Hill). Las células se expandieron en pocillos recubiertos con Matrigel a 37 °C, 5 % de CO2 en medios basales acondicionados con fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) complementados con 25 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, R&D Systems) y 1000 U/ml de inhibidor de leucemia. (LIF, Millipore) como se describió previamente3. Para los análisis de RNAseq y colesterol, las células se sembraron a 10-15 000 células/cm2 y se recolectaron 48 h después de alcanzar > 80 % de confluencia.

Las muestras de ARN para qPCR y RNAseq se extrajeron de cultivos por triplicado de células O9-1 cultivadas en diversas condiciones de sustrato y se purificaron con el kit RNeasy Mini (QIAGEN). La concentración de ARN se midió con el kit de ensayo Qubit™ RNA HS y un fluorómetro (Invitrogen).

Las bibliotecas se generaron con TruSeq RNA Library Prep Kit v2 (Illumina, RS-122–2001) según las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas purificadas se cuantificaron en un bioanalizador Agilent Technologies 2100 con un kit de ADN de alta sensibilidad Agilent. Las bibliotecas se secuenciaron en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 para generar lecturas de un solo extremo de 150 pares de bases. Se utilizó el software FastQC57 para evaluar la calidad de la secuenciación y se descartaron las lecturas con una puntuación de calidad phred < 20. Las lecturas de alta calidad restantes se alinearon con el genoma de referencia del ratón (mm10) con el alineador STAR58. La utilidad FeaturesCounts del paquete Subread se utilizó para cuantificar las lecturas que se alineaban con los genes de ratón Gencode v.32 y el análisis de expresión diferencial se realizó con DeSeq259,60. Los genes con log2 fold change > 1 y p ajustado por Bonferroni < 0,05 se consideraron expresados diferencialmente.

Los valores de expresión normalizados se obtuvieron utilizando el método de la mediana de las proporciones de DeSeq260. Los genes informativos para el análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA) se seleccionaron en función de la alta variabilidad y con valores de expresión normalizados > 5 en la mitad de las muestras. WGCNA se realizó con la utilidad blockwiseModule con el parámetro: umbral suave = 22, networkType = "firmado", TomType = "firmado", deepSplit = 2, minClusterSize = 30, cutTreeDynamic = 0,2522. Se fusionaron los módulos con un umbral de similitud superior a 0,25. Los genes con pertenencia al módulo > 0,6 para el módulo asignado se seleccionaron para el análisis de vías con el paquete de software R gProfileR61.

Se utilizó el software R (v 4.1.2) paquete WGCNA (v 1.71; https://bmcbioinformatics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2105-9-559?ref=https://githubhelp.com)22 a los paneles en la Fig. 1. La correlación entre el valor del gen propio del módulo, que es el primer componente principal de la matriz de expresión génica para un módulo dado y representa el patrón de expresión génica para ese módulo, y el sustrato de glucosa se muestra en la Fig. 1 Valores de correlación de Pearson entre el valor del gen propio del módulo y la disponibilidad del sustrato; glucosa alta (HG = glucosa 25 mM, piruvato 1 mM), glucosa de control (CG = glucosa 5,55 mM, piruvato 1 mM), sin glucosa (NG = glucosa 0 mM, piruvato 1 mM) y sin glucosa con 2 × piruvato ( NG2P = glucosa 0 mM, piruvato 2 mM) con valores p ajustados (entre paréntesis) se muestran en cada contenedor; correlación de 1 o -1 indica una fuerte relación positiva o negativa, respectivamente. Por ejemplo, la correlación positiva para el módulo azul indica que los genes dentro de ese módulo han aumentado la expresión génica a medida que el sustrato cambia de las condiciones experimentales de HG a NG2P. Por el contrario, los genes asignados al módulo turquesa han disminuido su expresión a medida que el sustrato cambia de condiciones HG a NG2P.

Los lípidos se extrajeron usando el kit de extracción de lípidos (Abcam) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sedimentos de células congeladas se trataron con tampón de extracción, se centrifugaron a 10 000 × g durante 5 min y los sobrenadantes se transfirieron a un tubo limpio y se secaron a 37 °C durante la noche. Los extractos se resuspendieron en 50 µL de tampón de resuspensión. Los niveles de colesterol total se midieron utilizando el kit de ensayo de colesterol rojo Amplex (Invitrogen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La fluorescencia de la muestra se midió mediante excitación a 550 nm y detección de emisión a 590 nm. Los niveles de colesterol se normalizaron a niveles de proteína y los resultados se expresaron como porcentaje de los niveles de colesterol en condiciones de vehículo HG.

Se realizaron ensayos de apoptosis Casp3/7 de células vivas Incucyte automatizados en tiempo real62 en cultivos que tenían una confluencia de ~ 30 %. Los ensayos se realizaron utilizando un sistema de análisis de células vivas Incucyte (Sartorius) a través del tratamiento directo con colorantes Incucyte Caspase-3/7, control mediante imágenes de lapso de tiempo (cada 2 h durante 3 días) y cuantificación de apoptosis utilizando Incucyte Cell-by -Módulo de software de análisis celular63 (Essen Bioscience). La migración de cNCC se examinó mediante el ensayo de herida por raspado Incucyte64. Brevemente, las células O9-1 se sembraron en placas Incucyte Imagelock recubiertas con Matrigel y se cultivaron en medios apropiados hasta que la monocapa celular alcanzó el 100 % de confluencia. Las heridas se crearon con la herramienta Woundmaker para crear zonas sin células precisas y uniformes en la monocapa de células. Se obtuvieron imágenes de los pocillos cada hora durante 36 h y se cuantificó la migración celular utilizando el módulo64 del software de análisis de heridas por raspado Incucyte (Essen Bioscience).

Las células O9-1 se sembraron en pocillos recubiertos con Matrigel en medio basal. Los cultivos monocapa se trataron inicialmente con medio osteogénico (α-MEM, 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,1 μM dexametasona, 10 mM de β-glicerofosfato, 50 μg/mL de ácido ascórbico y 100 ng/mL de mL de BMP2 (proveedor) durante 3 días.Después de 3 días, las células se cambiaron a medio condrogénico (α-MEM, 5 % de suero fetal bovino (FBS), 1 % de ITS (proveedor), 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 10 ng/mL de TGF-β3 (proveedor), 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 ng/mL de BMP2 (proveedor), 0,1 μM dexametasona y 1 mM de piruvato de sodio) y se cultivaron durante 7 días.

La diferenciación condrogénica se evaluó mediante tinción con azul de Alcian65. Se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con DPBS. A continuación, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se incubaron en solución de azul alcián (Millipore) durante 30 min; los núcleos se tiñeron con solución Nuclear Fast Red (Abcam). La tinción con azul alcián se midió mediante cuantificación espectrofotométrica de células en pocillos de 4 cm2/muestra a 620 nm.

Las células O9-1 se sembraron en pocillos recubiertos con Matrigel en medio basal. Los cultivos monocapa se mantuvieron en medio de diferenciación de músculo liso (DMEM, 10 % FBS, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) durante 7 días y se fijaron para los experimentos posteriores.

Para detectar la diferenciación del músculo liso, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,4 %/DPBS durante 10 min. Las células se bloquearon con BSA al 10 %/Tween 20 al 0,1 %, se incubaron con anticuerpo de actina de músculo liso (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpo secundario marcado con fluoróforo (Invitrogen); los núcleos se tiñeron con Hoechst 33.342.

Las células O9-1 se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS pH 7,4 durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron con PBS Triton X-100 al 0,4 % durante 10 min. Las células se bloquearon con BSA PBS al 10 %, Tween 20 al 0,1 %. Las células se incubaron con anticuerpo de actina de músculo liso (Santa Cruz Biotechnology) en BSA PBS al 3 %, Tween 20 al 0,1 %. Las células se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fluoróforo (Invitrogen) en BSA PBS 0,1% Tween 20. Los núcleos se tiñeron con Hoechst.

El ARN total se transcribió inversamente con el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando un sistema en tiempo real CFX96 con una supermezcla verde SYBR universal sso advanced (Bio-Rad). La expresión de β-actina se utilizó para normalizar el gen de interés en cada muestra. Se establecieron PCR cuantitativas en tiempo real utilizando los cebadores de oligonucleótidos β-actina F 5-CGCATCCTCTTCCTCCCTGG-3', β-actina R 5-GTGGTACCACCAGACAGCAC-3', Hmgcs F 5-TGATCCCCTTTGGTGGCTGA-3'; Hmgcs R 5'-AGGGCAACGATTCCCACATC-3', Hmgcr F 5-ATCCTGACGATAACGCGGTG-3'; Hmgcr R 5'-AAGAGGCCAGCAATACCCAG-3', 18S F 5-AAACGGCTACCACATCCAAG-3'; 18S R 5'-CGCTCCCAAGATCCAACTAC-3', Lss F 5-GGGCTGGTGATTATGGTGGT-3'; LssR 5'-CTCGATGTGCAAGCCCCA-3', Mvd F 5-ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG-3'; Mvd R 5'-TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT-3', Smchd1 F 5'-GATGGCCTTGACAGCTCAAAC-3, Smchd1 5'-CGCCAAGTAAAACACAGATCCTT-3', Srebf2 F 5-GACCGCTCTCGAATCCTCTTATGTG-3'; Srebf2 R 5'-GTTTGTAGGTTGGCAGCAGCA-3'. El cambio de pliegue se obtuvo calculando 2−ΔΔCt.

Los datos se analizaron usando Prism 9 (GraphPad Software). La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una vía con la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples y ANOVA de dos vías con la prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Todos los experimentos fueron realizados al menos tres veces. Los datos se presentan como medias ± SD y el nivel de significancia se fijó en p < 0,05.

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo están disponibles en el repositorio Sequence Read Archive (SRA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/), número de acceso: PRJNA883392.

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Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental [NIEHS] (1ZIAES103327-03 para NDS y Z01 ES102005 para MBF). NDS también recibe apoyo como becario de investigación clínica de Lasker (1SI2ES025429–01). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (1Z1AES103327-05 y Z01 ES102005). NDS también recibe apoyo como becario de investigación clínica de Lasker (1SI2ES025429-01).

Estos autores contribuyeron por igual: Florencia Pascual y Mert Icyuz.

Rama de Investigación Clínica, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, 111 TW Alexander Drive, MD D3-02, Research Triangle Park, NC, 27709, EE. UU.

Florence Easter, Mert Icyuz, Elizabeth Van Gorder y Natalie D. Shaw

Laboratorio de Inmunidad, Inflamación y Enfermedades, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, NC, EE. UU.

Peer Karmaus y Michael B. Fessler

Subdivisión de Bioestadística y Biología Computacional, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, 111 TW Alexander Drive, Research Triangle Park, NC, EE. UU.

ashley arroyos

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FP: concepción, diseño y realización de experimentos, recopilación de datos, análisis e interpretación de datos, redacción de artículos, MI: diseño y realización de experimentos, recopilación de datos, análisis e interpretación de datos, redacción de artículos, PK: análisis e interpretación de datos, edición papel, AB: análisis e interpretación de datos, papel de edición, EV: realización de experimentos, MBF: concepción, papel de edición, NDS: concepción, supervisión de experimentos, análisis e interpretación de datos, redacción y papel de edición. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Natalie D. Shaw.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Pascual, F., Icyuz, M., Karmaus, P. et al. La biosíntesis de colesterol modula la diferenciación en células de la cresta neural craneal murina. Informe científico 13, 7073 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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Recibido: 05 enero 2023

Aceptado: 04 abril 2023

Publicado: 01 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32922-9

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