Continuo escalable - El lago de los cisnes Co., Ltd de Shijiazhuang

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 6857 (2023) Citar este artículo

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Los vectores virales representan un cuello de botella en la fabricación de terapias celulares. La electroporación ha surgido como un enfoque para la transfección no viral de células primarias, pero los enfoques estándar basados en cubetas sufren de bajo rendimiento, optimización difícil e incompatibilidad con la fabricación de células a gran escala. Aquí, presentamos una nueva plataforma de electroporación capaz de una electroporación rápida y reproducible que puede transfectar de manera eficiente pequeños volúmenes de células para investigación y optimización de procesos y escalar a los volúmenes requeridos para aplicaciones en terapia celular. Demostramos la entrega de ADN plasmídico y ARNm a células T humanas primarias con alta eficiencia y viabilidad, como una eficiencia de transfección > 95 % para la entrega de ARNm con una pérdida de viabilidad celular < 2 % en comparación con las células de control. Presentamos métodos para escalar la entrega que logran un rendimiento experimental de 256 millones de células/min. Finalmente, demostramos una modificación terapéuticamente relevante de las células T primarias usando CRISPR/Cas9 para eliminar la expresión del receptor de células T (TCR). Este estudio muestra las capacidades de nuestro sistema para abordar las necesidades insatisfechas de ingeniería eficiente y no viral de células T para la fabricación de células.

Las terapias celulares han generado entusiasmo por su potencial para tratar una variedad de enfermedades hereditarias y adquiridas. En particular, las inmunoterapias que utilizan células T autólogas modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) han logrado tasas notables de respuesta completa con remisiones duraderas para ciertos cánceres hematológicos. La investigación se dirige hacia el tratamiento de otros tipos de cáncer, como los tumores sólidos. Sin embargo, la primera generación de terapias de células CAR-T aprobadas se basa en vectores virales como lentivirus o virus adenoasociados (AAV) para la reprogramación celular1,2,3,4,5. Los vectores virales han permitido la transducción de alta eficiencia de células inmunitarias humanas primarias difíciles de transfectar, pero tienen varios inconvenientes relacionados con sus complejos y costosos procesos de fabricación, inmunogenicidad y potencial de mutagénesis por inserción6,7,8. Además, el campo tiende hacia métodos de reprogramación más complejos, como la edición de genes múltiples a través de la tecnología CRISPR/Cas9 y la inserción de genes mediante elementos transposones, que no son compatibles con los límites de empaquetado típicos asociados con los enfoques virales9,10,11,12,13.

Para eludir estas limitaciones, los esfuerzos de investigación se han centrado cada vez más en métodos de transfección no virales para reemplazar la entrega viral9,14,15. Entre los métodos de transfección no virales, la electroporación es un enfoque bien estudiado que se usa comúnmente para administrar ADN, ARN y proteínas en las células y que se reconoce como uno de los principales candidatos para el reemplazo de vectores virales. Por ejemplo, Bozza et al. demostraron la capacidad de usar la electroporación para generar células T recombinantes usando nanovectores de ADN no integradores que eluden muchos de los inconvenientes asociados con los enfoques virales8. Del mismo modo, la electroporación se utilizó recientemente para generar células CAR-T mediante el uso del sistema de transposones Sleeping Beauty para el primer ensayo clínico con células CAR-T libres de virus en Europa16, así como con el sistema piggyBac17.

En el método estándar de electroporación estática que se ha utilizado durante muchos años, se crea un campo eléctrico aplicando pulsos eléctricos de alto voltaje a las suspensiones de células dentro de una cubeta18. Los pulsos de alto voltaje aplicados crean poros transitorios en la membrana celular que permiten que las moléculas se difundan en las células19,20. Sin embargo, la fuerza excesiva del campo eléctrico puede producir la ruptura irreversible de la membrana celular y la muerte celular. En el proceso estándar, el voltaje del pulso, el número de pulsos y la duración del pulso se encuentran entre los parámetros variados empíricamente para optimizar la eficiencia de la inserción molecular y la supervivencia celular. La optimización empírica puede ser tediosa y puede haber variabilidad en el proceso debido, entre otras cosas, a la ubicación aleatoria de las celdas con respecto a los electrodos21. Además, los métodos de electroporación tipo cubeta estándar tienen un rendimiento limitado incompatible con la fabricación de células a gran escala o automatizada22. Como tal, las limitaciones en la eficiencia de la transferencia molecular, la viabilidad celular, la variabilidad del proceso y el rendimiento limitado han limitado la aplicación generalizada de este método, aunque se entienden las ventajas potenciales sobre el uso de vectores virales.

Aquí, describimos una nueva plataforma de electroporación de microfluidos capaz de una electroporación rápida y reproducible que puede escalar sin problemas la entrega de la investigación a la escala clínica para aplicaciones en terapia celular. Nuestro enfoque incorpora una celda de flujo planar con una geometría de losa delgada que garantiza que cada celda esté sujeta al mismo campo eléctrico para una electroporación reproducible. En particular, el ancho del dispositivo en la dirección horizontal perpendicular al flujo se puede variar para que coincida con el rendimiento experimental deseado sin cambiar el campo eléctrico experimentado por las celdas. Usando nuestra plataforma, demostramos la entrega de ADN plasmídico y ARNm a células T primarias con alta eficiencia y un impacto mínimo en la viabilidad celular. Al escalar el ancho de nuestro dispositivo y otros parámetros, como la velocidad de flujo, demostramos cómo los parámetros de transfección identificados mediante la optimización multiplexada de pequeño volumen se pueden implementar fácilmente en las transfecciones a gran escala necesarias para la fabricación de células. Finalmente, usamos nuestra plataforma para realizar una modificación terapéutica de las células T primarias: suministro de complejos de ribonucleoproteína (RNP) CRISPR/Cas9 dirigidos contra el receptor de células T (TCR). Nuestros datos demuestran el potencial de nuestro sistema para abordar necesidades insatisfechas de ingeniería eficiente y no viral de células T para la fabricación de células.

Nuestra plataforma incorpora un canal de microfluidos de flujo continuo de un solo uso capaz de electrotransfección de células eficiente y reproducible. El canal de microfluidos consta de un chip de flujo plano con una geometría de losa delgada. Los electrodos están estampados en las superficies de flujo superior e inferior para aplicar un campo eléctrico uniforme perpendicular a la dirección del flujo (Fig. 1A). El campo eléctrico se aplica con una forma de onda de voltaje arbitraria de ciclo continuo. La altura del canal delgado, 80 µm, asegura que cada celda esté sujeta al mismo campo eléctrico y entorno químico para permitir una electroporación reproducible. La altura del canal delgado también nos permite lograr la intensidad de campo eléctrico necesaria para abrir transitoriamente los poros en la membrana plasmática, típicamente estimada entre 10 y 100 kV/m23, utilizando amplitudes de voltaje relativamente bajas (alrededor de 1 a 8 V) en comparación con el alto voltaje. de los sistemas comerciales tradicionales. Por ejemplo, para nuestra altura de canal de 80 µm, un voltaje aplicado de 10 V da como resultado una intensidad de campo eléctrico de 125 kV/m. Estas amplitudes de voltaje relativamente bajas, en combinación con un tampón de electroporación de baja conductividad, un flujo de fluido constante y un ciclo continuo de la forma de onda de voltaje, evitan problemas con la formación de burbujas inducidas por hidrólisis dentro del canal de microfluidos que, de otro modo, podrían interferir con la electroporación. El ancho (2 o 10 mm) de los dispositivos utilizados en estos experimentos es mucho mayor que su profundidad para permitir un flujo rápido y continuo de las células a través del chip (Fig. 1B). Es importante destacar que el ancho del dispositivo puede ser superior a 10 mm y variar para que coincida con el rendimiento experimental deseado sin cambiar el campo eléctrico que experimentan las células. Como tal, nuestra geometría plana permite determinar los parámetros de transfección óptimos utilizando pequeños volúmenes y anchos de canal antes de escalar a grandes volúmenes y anchos de canal para la entrega a escala clínica.

Descripción general de la plataforma de electroporación CyteQuest. (A) Esquema de vista lateral y (B) superior de la celda de flujo de electroporación (no a escala). (C) Fotografía de una celda de flujo experimental con colectores adjuntos, tubos y tres conjuntos de electrodos direccionables de forma independiente. (D) Diagrama de bloques que representa los componentes que componen la plataforma de electroporación. (E) Gráfico que representa una forma de onda rectangular bipolar con frecuencia f, duración t y amplitud de voltaje, V.

Nuestro dispositivo está diseñado para integrarse con enfoques de procesamiento de células automatizado utilizando una forma de onda de voltaje seleccionable y controlada por computadora y recolección de fracciones robóticas. Nuestra plataforma es capaz de entregar cualquier forma de onda eléctrica arbitraria. Durante el funcionamiento típico, las células se introducen en el canal mediante una bomba de jeringa a través de una única entrada de fluido y salen a través de una única salida de fluido (Fig. 1C). Las celdas normalmente se suspenden en un tampón de electroporación de baja conductividad que contiene la carga que se entregará. Para optimizar la electrotransfección, un script de MATLAB personalizado controla un generador de funciones que contiene formas de onda eléctricas preprogramadas, mientras que un muestreador automático robótico está programado para mover el tubo de salida para dispensar en una placa de pocillos múltiples (Fig. 1D). Para cambiar rápidamente la forma de onda eléctrica aplicada a las celdas, la celda de flujo está diseñada con un volumen mínimo (~ 11 µL) aguas abajo de los pares de electrodos. Este volumen aguas abajo se divide entre el tubo de salida (~ 6 µL) y el canal de flujo (~ 5 µL). Como tal, a medida que se intercambia la forma de onda eléctrica preprogramada, las celdas que salen del tubo de salida representan casi instantáneamente las celdas que han recibido la nueva forma de onda. Al sincronizar el muestreador automático robótico para que se sumerja en el pozo durante el cambio de forma de onda, podemos garantizar un alto grado de pureza en cada pozo. El período de condiciones de muestra mixta introducido por la transición de las condiciones de voltaje aplicado se diluye por el tiempo de permanencia relativamente largo por pozo (10 s) que es un factor de 5 veces mayor que la velocidad de intercambio (~ 2 s). Como tal, nuestra plataforma puede optimizar rápida y fácilmente los parámetros eléctricos para la transfección. En este estudio, nos enfocamos en el uso de formas de onda rectangulares bipolares que pueden describirse por su frecuencia (f), duración (t) y amplitud de voltaje (V) (Fig. 1E). En general, esta configuración robótica permite un barrido rápido de parámetros eléctricos para seleccionar las condiciones deseables para la transfección. A continuación, se realiza una transfección a mayor escala con las condiciones eléctricas seleccionadas.

A medida que se aplican formas de onda a las celdas, el script personalizado de MATLAB también controla un osciloscopio para monitorear las formas de onda de voltaje. Medimos la corriente midiendo la caída de voltaje a través de una resistencia de 1 Ω en serie con el chip de flujo. En la Fig. 2 se muestran gráficos representativos del voltaje y la corriente en función del tiempo en un chip de 2 mm de ancho. Algunos elementos reactivos están presentes a medida que la corriente decae ligeramente durante el intervalo de 100 µs en el que se aplica el voltaje. La corriente promedio es de aproximadamente 7 mA para un voltaje de 23 V. Calculamos el campo eléctrico, \(\overrightarrow{E}\), dentro de la región entre los electrodos usando la ley de Ohm, \(\overrightarrow{J}=\sigma \overrightarrow{E}\), donde \(\overrightarrow{ J}\) es la corriente por unidad de área (del electrodo) y \(\sigma\) es la conductividad del tampón. Usando el valor medido de la conductividad (9 × 10–3 S/m) y las dimensiones del electrodo, encontramos un campo eléctrico de aproximadamente 278 kV/m. Esto concuerda bien con una estimación simple que asume que los electrodos constituyen una placa paralela separada por un conductor, en cuyo caso la intensidad del campo eléctrico es el voltaje aplicado dividido por la altura del canal de 80 micrones. Esta estimación ignora los efectos capacitivos debidos a los iones que se acumulan en la superficie del electrodo. Sin embargo, para un voltaje aplicado de 23 V, este modelo produce una estimación del campo eléctrico de 288 kV/m.

Trazas de osciloscopio promediadas en el tiempo que muestran el voltaje y la corriente variables en el tiempo medidos por el osciloscopio. (A) Ciclos múltiples del canal de voltaje de una forma de onda rectangular bipolar con f = 66 Hz, V = 23 V y t = 100 µs. El cuadro punteado representa una región de tiempo ampliada de la forma de onda con el voltaje (B) correspondiente a través del canal y la corriente (C) a través del canal. Promedio de tiempo: 64 trazas.

Para demostrar la capacidad de nuestra plataforma para entregar ARNm, transfectamos Jurkat y células T primarias con ARNm que codifica GFP. Se transfectaron células T primarias de donantes sanos 4 días después de la activación con anticuerpos CD3/CD28. Ambos tipos de células se resuspendieron a una concentración de 5 × 106 células/mL en un tampón de electroporación de baja conductividad que contenía ARNm codificante de GFP a 20 µg/mL o 40 µg/mL, se cargaron en una jeringa y se introdujeron en nuestra celda de flujo de electroporación como descrito en nuestros métodos. A medida que las células transitan por debajo del electrodo, la frecuencia de la forma de onda se seleccionó de manera que las células recibieran tres formas de onda rectangulares bipolares (Fig. 1E) en promedio durante su tiempo de tránsito a través del campo eléctrico (t = 100 µs, f = 100 Hz). Este valor se dedujo de la velocidad lineal promedio, la tasa de flujo volumétrico y la dimensión del electrodo a lo largo de la dirección del flujo. Como control, las células se recogieron con voltaje aplicado cero.

Para medir el rendimiento de la entrega, las células se analizaron 24 h después de la transfección mediante citometría de flujo (Fig. 3A, B). Para cada condición de voltaje, el recuento de células, la viabilidad y la expresión de GFP se midieron directamente a través de activación sucesiva como se describe en los métodos. La viabilidad para cada condición de voltaje se calculó como el número de células viables (Nviable), medido con un colorante de viabilidad (7-AAD), dividido por el número total de células en esa condición de voltaje, medido 24 h después de la transfección (Ntotal) .

Entrega de ARNm que codifica GFP a Jurkat y células T primarias. (A) Gráficos representativos de citometría de flujo de control de voltaje cero o (B) células Jurkat electroporadas que representan la morfología celular, la viabilidad y la expresión de GFP. (C) Impacto de la variación de la amplitud del voltaje de la forma de onda en la entrega utilizando 20 o 40 µg/ml de ARNm en células Jurkat (n = 3). (D) Entrega de alta eficiencia usando 40 µg/ml de ARNm para células T primarias de cuatro donantes sanos (n = 4). Datos mostrados como media ± desviación estándar (C,D). Algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles (C).

Para las células T primarias, se calculó una relación de viabilidad debido a que la viabilidad inicial de cada donante de células T osciló entre el 83 y el 92 %, independientemente de la electroporación. La relación de viabilidad se calculó como la viabilidad (ecuación 1) dividida por la viabilidad de las celdas de control de voltaje cero (control de voltaje cero de viabilidad).

La viabilidad de las celdas de control de voltaje cero se mide 24 horas después de la transfección a partir de celdas que fluyeron a través del dispositivo sin un campo eléctrico aplicado. La expresión de GFP se definió como el número de células viables y de expresión (Nexpressing) dividido por el número de células viables.

Dado que nuestra medida de viabilidad no tiene en cuenta las células que se han perdido durante la electroporación (es decir, la lisis completa), también calculamos el rendimiento relativo como el número total de células en cada condición de voltaje (Ntotal) dividido por el número de células de control de voltaje cero. (N control de voltaje cero).

Dado que el rendimiento relativo se mide a partir de los recuentos de células 24 h después de la transfección, esta medida está influenciada por la variación en la siembra celular, la variación en la tasa de proliferación y la lisis o pérdida celular durante la electroporación.

Probamos la entrega de ARNm a células Jurkat usando 20 o 40 µg/mL de ARNm que codifica GFP y una amplitud de voltaje de forma de onda que oscila entre 3 y 11 V (Fig. 3C). A medida que aumentaba la amplitud del voltaje de la forma de onda, observamos un efecto de umbral en el que la expresión de GFP estaba ausente por debajo de 5 V, luego aumentó hasta alcanzar un valor de meseta de ~ 97 % a 11 V. En todas las amplitudes de voltaje y concentraciones de ARNm probadas, la viabilidad permaneció sin cambios relativos a controles de voltaje cero, mientras que el rendimiento relativo se mantuvo> 90% (Fig. 3C, Figura S1A). En particular, observamos una expresión de GFP del 95 % ± 1,8 % de las células T primarias derivadas de cuatro donantes sanos, mientras que el índice de viabilidad y el rendimiento relativo fueron del 98 % ± 1,4 % y del 92 % ± 6,6 %, respectivamente (Fig. 3D, Figura S1B) . En la Figura S2 se muestran imágenes microscópicas representativas de células T primarias que expresan ARNm que codifica GFP. Como tal, estos datos demuestran la capacidad de nuestra plataforma para entregar ARNm con alta eficiencia sin afectar la viabilidad celular.

Como comparación con nuestro sistema de microfluidos, transfectamos células T primarias con ARNm que codifica GFP (40 µg/mL) utilizando un sistema de electroporación basado en cubetas, Gene Pulser de Bio-Rad. Las células T primarias se cultivaron y prepararon de manera similar a nuestro sistema, excepto que las células se suspendieron en tampón de electroporación Gene Pulser en lugar de tampón de baja conductividad. Observamos una expresión de GFP del 83 ± 9 % con un índice de viabilidad del 91 ± 10 % (Figura complementaria S3). Estos son similares a los valores informados por Bio-Rad, que informa una expresión máxima de GFP del 81 % y una viabilidad del 91 % de las células T primarias transfectadas con la misma construcción de ARNm (1). Dado que nuestra plataforma proporciona valores más altos tanto para la expresión como para la viabilidad de GFP, estos resultados demuestran cómo nuestra plataforma supera al sistema de cubetas Gene Pulser para la entrega de ARNm.

Dado que las terapias celulares autólogas actuales requieren grandes volúmenes de células modificadas24, examinamos tres métodos fácilmente disponibles con nuestra plataforma para aumentar el rendimiento del procesamiento celular: (1) aumentar proporcionalmente el ancho del canal de flujo y la tasa de flujo volumétrico, (2) aumentar proporcionalmente el flujo de fluido la velocidad y la frecuencia de la forma de onda, y (3) el aumento de la concentración celular en el tampón de electroporación.

Aumentar la velocidad de flujo volumétrico y el ancho del canal por el mismo factor deja sin cambios la velocidad de flujo lineal promedio de las celdas debajo del electrodo y, por lo tanto, no afecta el entorno eléctrico o químico de las celdas. Aumentamos el ancho del canal de 2 mm, utilizado en nuestro estudio de optimización, a 10 mm mientras aumentamos proporcionalmente la tasa de flujo volumétrico de 320 μL/min a 1,6 mL/min (Fig. 4A,B). Las células Jurkat se sometieron a electroporación con ARNm que codifica GFP (20 µg/mL) en ambos canales usando una forma de onda rectangular bipolar (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 13 V) a una concentración de 5 × 106 células/mL como se describe previamente. En particular, la expresión, la viabilidad y el rendimiento relativo de GFP fueron aproximadamente idénticos en el canal de 2 y 10 mm, mientras que el rendimiento del procesamiento celular aumentó en un factor de cinco de 1,6 × 106 a 8 × 106 células/min (Fig. 4C, Figura S4A ). Estos resultados indican que aumentar proporcionalmente el ancho del canal de la celda de flujo y la tasa de flujo volumétrico presenta un método fácil para aumentar sin problemas el rendimiento del procesamiento de la celda.

Aumento del rendimiento de procesamiento celular para volúmenes a escala clínica. (A) Fotografía de una celda de flujo de electroporación de 2 mm y (B) 10 mm. Las flechas rojas resaltan el ancho del canal. (C) Gráfico de valores de expresión y viabilidad de GFP de células Jurkat transfectadas con ARNm que codifica GFP en los canales de 2 o 10 mm (n = 3). (D) Gráfico de expresión de GFP y valores de viabilidad de células Jurkat transfectadas con ARNm que codifica GFP en el canal de 2 mm en concentraciones celulares variables en el tampón de electroporación (n = 3). (E) Gráfico de valores de expresión y viabilidad de GFP de células Jurkat transfectadas con ARNm que codifica GFP en el canal de 10 mm a diferentes velocidades de flujo y frecuencias de forma de onda (n = 3). (F) Gráfico de expresión y viabilidad de GFP a lo largo del tiempo de un experimento que transfectó ~ 240 millones de células durante 56 s (n = 1). Datos mostrados como media ± desviación estándar (C–E). Algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles (C–E).

Probamos el aumento de la concentración de células dentro del tampón de electroporación como método para aumentar el rendimiento del procesamiento celular. Las células Jurkat se sometieron a electroporación con ARNm que codificaba GFP (20 µg/ml) utilizando una forma de onda rectangular bipolar (t = 100 µs, V = 13 V, f = 100 Hz) como se describió anteriormente. Probamos las células de transfección a una concentración de 5, 10 o 20 × 106 células/mL y no observamos diferencias en la expresión, viabilidad o rendimiento relativo de GFP (Fig. 4D, Figura S4B). Como tal, aumentar la concentración de células durante la transfección ofrece otro método sencillo para mejorar el rendimiento del procesamiento de células.

Además de aumentar el ancho del canal o la concentración celular, también aumentamos proporcionalmente la tasa de flujo volumétrico y la frecuencia de la forma de onda eléctrica para aumentar el rendimiento. Las células Jurkat se sometieron a electroporación con ARNm que codifica GFP (20 µg/mL) usando una forma de onda rectangular bipolar (t = 100 µs, V = 13 V) a una concentración de 5 × 106 células/mL como se describió anteriormente. Probamos aumentando la frecuencia de la forma de onda de 100 a 800 Hz con un aumento proporcional en el caudal volumétrico de 1,6 a 12,8 ml/min. No observamos diferencias en la expresión, viabilidad o rendimiento relativo de GFP (Fig. 4E, Figura S4C). Es importante destacar que el aumento proporcional de la frecuencia de la forma de onda y la tasa de flujo aumentó el rendimiento de las celdas de 8 × 106 a 64 × 106 celdas/min. Como tal, este método puede aumentar considerablemente el rendimiento del procesamiento celular sin cambiar la geometría del canal de flujo.

Finalmente, combinamos todos los métodos antes mencionados para aumentar el rendimiento del procesamiento celular en un solo experimento para entregar de manera eficiente GFP que codifica el ARNm a aproximadamente 240 millones de células Jurkat en una demostración de una transfección a escala clínica. Las células Jurkat se transfectaron con ARNm (20 µg/mL) utilizando una forma de onda rectangular bipolar (t = 100 µs, V = 13 V, f = 800 Hz) a una concentración de 20 × 106 células/mL mientras fluía a 12,8 mL/min. . A una velocidad de procesamiento de 256 millones de células/min, la entrega a 240 millones de células tomó aproximadamente 56 s. Tomamos muestras de células en varios momentos durante el parto y encontramos que la expresión y viabilidad de GFP eran consistentes a lo largo del tiempo en 97 ± 0,12 % y 96 ± 0,39 %, respectivamente (Fig. 4F). El rendimiento relativo fue más variable al 73% ± 5%. En general, la variedad de métodos disponibles en nuestra plataforma para aumentar el rendimiento del procesamiento celular proporciona una entrega altamente eficiente a las velocidades requeridas para la entrega a escala clínica.

Para demostrar la entrega de ADN plasmídico, usamos formas de onda rectangulares bipolares con una duración fija (t = 100 µs) y probamos el impacto de variar tres parámetros con células T Jurkat y pan primarias: amplitud de voltaje de forma de onda (V), frecuencia de forma de onda (f ), y concentración de plásmido.

Se prepararon células Jurkat y pan T primarias como se describió anteriormente. Tanto para Jurkat como para las células T primarias, el aumento de la concentración de ADN de plásmido que codifica GFP resultó en una mayor expresión de GFP, menor viabilidad y menor rendimiento relativo (Fig. 5A,C, Figura S5A,B). En la Figura S6 se muestran imágenes microscópicas representativas de células T primarias que expresan ADN plasmídico que codifica GFP. Curiosamente, el aumento de la concentración de plásmido tuvo rendimientos decrecientes con menores ganancias en la expresión de GFP a medida que aumentaba la concentración de plásmido. De manera similar, el aumento de la frecuencia de la forma de onda también aumentó la expresión de GFP con rendimientos decrecientes significativos al tiempo que disminuyó la viabilidad y el rendimiento relativo (Fig. 5B, D, Figura S5C, D). Probamos tres valores de frecuencia de forma de onda que corresponden a células que reciben en promedio 1 (33 Hz), 2 (66 Hz) o 3 (100 Hz) formas de onda por tiempo de tránsito debajo del electrodo. El caudal volumétrico se mantuvo constante en todos los casos. En general, hubo un gran aumento en la expresión de GFP de 33 a 66 Hz y casi ningún aumento adicional de 66 a 100 Hz. Las células Jurkat mostraron un rendimiento reproducible en tres experimentos independientes con valores de desviación estándar que oscilan entre el 1 y el 4 % para la expresión de GFP y entre el 1 y el 5 % para la viabilidad. Las células T primarias exhibieron una variación significativa de donante a donante (Figuras S7, S8). En general, al variar tres parámetros, pudimos ajustar la expresión y viabilidad del plásmido dentro de un amplio rango de valores para ambos tipos de células.

Resultados de varios parámetros de transfección para administrar ADN plasmídico que codifica GFP a Jurkat y células T primarias. (A) Impacto de la variación de la concentración de plásmido o (B) la frecuencia de la forma de onda para administrar ADN de plásmido a las células Jurkat. (C) Impacto de la variación de la concentración de plásmido o (D) la frecuencia de la forma de onda para administrar ADN de plásmido a las células T primarias. Datos mostrados como media ± desviación estándar; n = 3 (A,B). Datos mostrados como valores de un donante representativo; n = 1 (C, D). Algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles para las celdas Jurkat (A,B).

Como comparación con nuestro sistema de microfluidos, transfectamos células T primarias con ADN plasmídico que codifica GFP (75 µg/mL) utilizando el sistema de cubetas Gene Pulser. Las células T primarias transfectadas en Gene Pulser con ADN de plásmido exhibieron una expresión de GFP del 62 ± 15 % y una relación de viabilidad del 70 ± 19 % (Figura complementaria S3). En nuestro sistema, para las condiciones de entrega más similares, informamos 65 ± 7 % de expresión de GFP y 70 ± 9 % de índice de viabilidad (f = 33 Hz, V = 29 V, t = 100 µs). Valores medios similares para la relación de expresión y viabilidad de GFP sugieren un rendimiento similar para la entrega de ADN plasmídico. Sin embargo, nuestra plataforma de microfluidos proporciona valores más bajos para la desviación estándar, lo que probablemente se deba al campo eléctrico uniforme inherente a la geometría de placa delgada de nuestro chip de flujo. Los valores de desviación estándar más bajos para la expresión y viabilidad de GFP ofrecen una clara ventaja de nuestra plataforma de microfluidos.

Para demostrar la flexibilidad de nuestra plataforma, entregamos ADN plasmídico que codifica GFP a células Jurkat utilizando una forma de onda arbitraria. Seleccionamos una forma de onda de nivel dual caracterizada por un segmento de amplitud alta y duración corta (V1, t1) que se piensa que nuclea los poros seguido de un segmento de amplitud baja y duración más larga (V2, t2) que se piensa que hace crecer los poros y conduce electroforéticamente carga cargada, como el ADN, en la celda25,26 (Fig. 6A). Algunos grupos han descubierto que las formas de onda de doble nivel equilibran favorablemente la expresión del ADN plasmídico con la viabilidad celular. Motivados por estos informes, y como una demostración de las capacidades de nuestro sistema, seleccionamos f = 66 Hz, V1 = 21 V y t1 = 75 µs y medimos el impacto de variar V2 o t2 del segmento de baja amplitud y mayor duración. (Figura 6A).

Entrega de una forma de onda eléctrica arbitraria. (A) Gráfico que representa una forma de onda bipolar de voltaje dual caracterizada por un segmento de amplitud alta y duración corta (V1, t1) seguido de un segmento de amplitud baja y duración larga (V2, t2) (B) Impacto de la variación de V2 mientras que t2 = 250 µs (n = 3). (C) Impacto de variar t2 mientras V2 = 4 V (n = 3). Tanto en (B) como en (C), fijamos f = 66 Hz, V1 = 21 V y t1 = 75 µs. Datos mostrados como media ± desviación estándar (B,C). Algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles (B,C).

Las células Jurkat se prepararon como se describió anteriormente. La eficiencia de la transfección se definió como el producto de la expresión y la viabilidad de GFP y se calculó como una métrica única para comparar el rendimiento de la forma de onda. A medida que aumentó V2 o t2, la expresión de GFP aumentó mientras que la viabilidad y el rendimiento relativo disminuyeron (Fig. 6B, C, Figura S9). En particular, nuestra métrica para el rendimiento de la forma de onda, la eficiencia, exhibió un valor máximo en valores intermedios de V2, lo que representa cómo una forma de onda de nivel de voltaje dual puede equilibrar favorablemente la expresión y la viabilidad de GFP. En general, estos datos demuestran las capacidades de nuestra plataforma para entregar una forma de onda de voltaje arbitraria y cómo esta capacidad podría brindar ventajas para mejorar el rendimiento de la electroporación del ADN plasmídico.

Para demostrar nuestras capacidades para entregar carga más allá de GFP, luego recurrimos al sistema CRISPR-Cas9. Elegimos apuntar a los loci TRAC y TRBC, que codifican las cadenas alfa y beta de TCR, porque la eliminación de la expresión de TCR se está estudiando como un método para evitar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) para la ingeniería de células CAR T alogénicas14. Las células T primarias de donantes sanos se transfectaron 4 días después de la activación con anticuerpos CD3/CD28 usando formas de onda rectangulares bipolares (t = 100 µs, f = 100 Hz, V = 5–29 V) y usando CRISPR-Cas9 RNP (1 µM) . La expresión de TCR, el índice de viabilidad y el rendimiento relativo se midieron 72 h después de la transfección utilizando anticuerpos contra TCR humanos y citometría de flujo. A medida que aumentaba la amplitud del voltaje de la forma de onda, la expresión de TCR caía abruptamente de 89 ± 1,0 % a 7,4 ± 1,0 % (Fig. 7). La relación de viabilidad también disminuyó al aumentar el voltaje con cambios mínimos hasta 25 V, lo que produjo una expresión de TCR del 12 ± 2,1 % y una relación de viabilidad del 88 ± 1,0 %. Después de 25 V, la relación de viabilidad cayó bruscamente. A continuación, medimos la capacidad proliferativa de las células de control (0 V) y electroporadas (25 V y 29 V) durante un período de 7 días posterior a la transfección (Figura S10). Las células T de control de voltaje cero se expandieron rápidamente, experimentando múltiples duplicaciones de población durante el período de observación de 7 días. Las células T sometidas a electroporación con la forma de onda de 25 V exhibieron una tasa de proliferación más baja durante 2 días después de la electroporación en relación con las células de control. Después de este período de recuperación, las células que recibieron la forma de onda de 25 V proliferaron a un ritmo idéntico al de las células de control. Las células T que recibieron una amplitud de forma de onda más alta mostraron una menor capacidad proliferativa. Estos resultados representan la compensación entre eficiencias de transfección muy altas y la salud celular. En general, estos datos sugieren que nuestra plataforma tiene la capacidad de realizar ingeniería genética CRISPR/Cas9, que es una técnica prometedora para hacer avanzar las terapias celulares más allá de las terapias celulares autólogas actualmente aprobadas.

Entrega de CRISPR/Cas9 RNP dirigidos a TRAC/TRBC. Gráfico de expresión de TCR, índice de viabilidad o rendimiento relativo en función de la amplitud del voltaje aplicado, medido 72 h después de que las células T primarias se transfectaran con CRISPR/Cas9 RNP dirigidas a TRAC/TRBC (n = 3). Datos mostrados como media ± desviación estándar. Algunas barras de error son demasiado pequeñas para ser visibles.

La electroporación representa un enfoque prometedor para reemplazar los métodos basados en virus para fabricar terapias celulares, pero los métodos tradicionales tipo cubeta siguen estando limitados por la variabilidad del proceso, la optimización difícil y el bajo rendimiento. Aquí, presentamos una nueva plataforma de electroporación que elude estas limitaciones mediante la incorporación de una celda de flujo plana junto con la experimentación automatizada. Como lo demuestran nuestros datos de rendimiento, podemos explorar rápidamente un gran espacio de parámetros para derivar las condiciones para la entrega eficiente de diferentes cargas moleculares a las células. Es importante destacar que también demostramos cómo las optimizaciones realizadas con pequeños volúmenes se pueden traducir directamente en transfecciones a gran escala para la fabricación de células. Juntas, estas innovaciones demuestran el potencial de nuestra plataforma para abordar necesidades insatisfechas de ingeniería no viral de células T para la fabricación de células.

Observamos una entrega de alta eficiencia de ARNm que codifica GFP para Jurkat y células T primarias (> 98 % para Jurkat, > 95 % de células T primarias) sin afectar significativamente la viabilidad celular o el rendimiento relativo de nuestro dispositivo. Nuestro rendimiento de entrega de ARNm supera los valores informados de los dispositivos de electroporación estilo cubeta y cumple o supera las métricas de rendimiento de otros enfoques de transfección microfluídicos no virales27,28,29,30. Para nuestras comparaciones con otros enfoques, incluidas nuestras transfecciones con el sistema Gene Pulser, es importante tener en cuenta que las condiciones experimentales pueden alterar significativamente el rendimiento de la transfección, incluida la preparación de células, las concentraciones de células o cargas y la elección del tampón de electroporación31,32,33. Es importante destacar que pudimos escalar sin problemas la entrega de ARNm aumentando la concentración de células en el tampón de electroporación, el ancho del canal, la velocidad de flujo y la frecuencia de la forma de onda. La combinación de estos métodos de escalamiento nos permitió aumentar el rendimiento hasta 256 millones de células/min usando un ancho de canal de 10 mm, un ancho que se puede expandir aún más. En general, nuestros resultados indican que al aumentar el ancho de nuestro canal y usar condiciones de flujo, químicas y eléctricas demostradas, podemos cumplir con las cantidades de células requeridas para terapias celulares que a menudo requieren más de mil millones de células14,34,35.

Las terapias actuales de células T autólogas requieren una fabricación larga y costosa que restringe su uso clínico a gran escala14. Las células CAR-T universales "disponibles" o alogénicas de donantes sanos podrían superar estas limitaciones, pero las células CAR-T alogénicas pueden ser rápidamente eliminadas por el sistema inmunitario del huésped y también pueden causar una enfermedad de injerto contra huésped potencialmente mortal ( EICH)35,36. La interrupción de los genes que codifican TCR-α (TRAC) y TCR-β (TRBC) se ha informado en otros lugares como un método para reducir el riesgo de GVHD y actualmente se está investigando en estudios preclínicos y ensayos clínicos36,37,38,39. Aquí, demostramos la entrega de CRISPR-Cas9 RNP para eliminar de manera eficiente la expresión primaria de células T de TCR para mostrar cómo nuestro dispositivo podría usarse para la fabricación de células CAR-T alogénicas de próxima generación.

La geometría de losa delgada y los electrodos de placas paralelas de nuestra celda de flujo es la innovación que brinda muchas de las fortalezas de nuestra plataforma, incluida (1) la capacidad de someter cada celda al mismo campo eléctrico y (2) la capacidad de escalar a cualquier rendimiento deseado con esfuerzo mínimo. Estas innovaciones distinguen nuestro enfoque de otros enfoques para desarrollar dispositivos de transfección microfluídicos no virales. La altura del canal delgado (80 µm) crea una geometría de placas paralelas con un campo eléctrico espacialmente uniforme que produce una electroporación altamente reproducible. Informamos desviaciones estándar para la expresión y viabilidad de GFP habitualmente por debajo del 5%. Además, la altura del canal delgado nos permite alcanzar la intensidad de campo eléctrico necesaria, normalmente alrededor de 10 a 100 kV/m, para la electroporación con una amplitud de voltaje relativamente baja (alrededor de 1 a 8 V) en comparación con los sistemas comerciales tradicionales o algunos otros dispositivos de electroporación de microfluidos28. Por ejemplo, observamos que la expresión de ARNm comenzó con una amplitud de voltaje de 5 V y se estabilizó alrededor de 11 V. Como tal, nuestro dispositivo puede evitar el uso de altos voltajes. Nuestro dispositivo también incorpora un sistema de flujo fluídico simple y único que contrasta con enfoques más complejos, como el sistema de flujo múltiple empleado por Lissandrello et al.28.

La arquitectura plana del chip de flujo, con una relación entre la dimensión estrecha y ancha perpendicular al flujo inferior al 10 %, juega un papel importante en la capacidad de aumentar el ancho y el caudal sin afectar el entorno eléctrico de las celdas. En un dispositivo de microfluidos con una sección transversal circular, o uno donde el radio de ancho a alto es aproximadamente 1, la velocidad del fluido tiene una forma parabólica a lo largo del canal con un máximo en su centro. Como se discutió en Brody et al., el perfil de velocidad en un canal rectangular adquiere "forma de tapón" a lo largo de la dimensión ancha cuando la relación entre la dimensión estrecha y ancha es inferior al 10 %40. Este perfil en forma de tapón es constante hasta que cambia a velocidad cero en los bordes en una distancia comparable a la altura del canal. Este perfil de velocidad en forma de tapón es una característica bien conocida del llamado flujo de Hele-Shaw en una celda de flujo rectangular con una relación de aspecto estrecha a ancha. Esto implica que el tiempo que una celda está sujeta a un campo eléctrico en la celda de flujo que describimos es esencialmente constante para cualquier posición a lo largo del ancho de la celda de flujo (excepto cerca de los bordes, como se detalla). Si aumentamos el rendimiento de dicho dispositivo aumentando proporcionalmente el ancho y el caudal volumétrico, esta característica sigue siendo válida. El perfil de velocidad del flujo en la dirección vertical es parabólico. Sin embargo, dado que el tamaño de las celdas es una fracción no despreciable de la altura del canal, la dispersión de la velocidad del flujo en la dirección vertical es menor que la dispersión de partículas pequeñas. Es importante destacar que el perfil parabólico de la velocidad del flujo en la dirección vertical no afecta nuestra capacidad para escalar el rendimiento al aumentar proporcionalmente el ancho y la tasa de flujo volumétrico debido al flujo de Hele-Shaw mencionado anteriormente en la dimensión ancha. Por lo tanto, los parámetros de electroporación optimizados en un dispositivo de baja muestra no se modifican en un dispositivo de este tipo con una mayor anchura y velocidad de flujo.

Aquí, demostramos nuestra función de escalado comparando el rendimiento de la transfección entre dos celdas de flujo diferentes con diferentes anchos de canal: un canal de 2 mm y un canal de 10 mm. Aumentar el ancho del canal y la tasa de flujo por un factor de cinco aumentó el rendimiento experimental por un factor de cinco con un rendimiento idéntico utilizando una forma de onda eléctrica idéntica. Esta capacidad de determinar los parámetros de transfección utilizando pequeños volúmenes de células y reactivos y traducir directamente los parámetros optimizados para la entrega de gran volumen a escala clínica es una ventaja clave de nuestra plataforma. En particular, aunque existen muchas otras plataformas de flujo continuo capaces de realizar transfecciones no virales de células T primarias, ninguna proporciona la capacidad de escalado continuo inherente a nuestra geometría de placas delgadas de ancho variable. Por ejemplo, los enfoques de mecanoporación logran la entrega a través de constricciones físicas que abren temporalmente la membrana plasmática41,42. Sin embargo, el escalado requiere paralelización porque el caudal y las dimensiones del canal influyen en los parámetros de transfección.

Aunque muchos grupos están desarrollando enfoques microfluídicos no virales que demuestran la entrega de la carga de ARNm a las células T primarias, hay comparativamente pocos datos sobre su desempeño utilizando ADN plasmídico28,29,30. Aquí, demostramos la entrega eficiente de ADN de plásmido tanto a Jurkat como a células T primarias. En comparación con la entrega de ARNm, la entrega eficiente de ADN de plásmido que codifica GFP requirió aproximadamente el doble de la fuerza del campo eléctrico y produjo valores más bajos de eficiencia de transfección, viabilidad y rendimiento relativo. Es probable que existan múltiples explicaciones para la dificultad de administrar ADN plasmídico, y los mecanismos de transporte exactos para la electrotransferencia de ADN aún no se comprenden bien43,44. La relativa facilidad de entrega de ARNm probablemente esté influenciada por la necesidad de que el ADN entre en el núcleo para su expresión y por el tamaño relativamente pequeño de nuestra carga de ARNm (~ 1 kB) en relación con nuestra carga de ADN plasmídico (~ 3,7 kB). Se ha informado anteriormente que el aumento del tamaño del plásmido tiene un impacto negativo en la eficiencia y viabilidad de la transfección45. Además, el ADN plasmídico tiene patrones moleculares asociados a patógenos, como motivos CpG no metilados, que pueden desencadenar la apoptosis46. La citotoxicidad asociada con motivos CpG podría explicar nuestra observación de que el aumento de la concentración de ADN plasmídico disminuyó la viabilidad celular independientemente de los parámetros de forma de onda eléctrica. A medida que la concentración de ADN de plásmido aumentó dentro del tampón de electroporación, observamos una expresión de GFP más brillante (datos no mostrados), lo que sugiere una mayor electrotransferencia de plásmido que también podría explicar la disminución de la viabilidad celular independientemente de los parámetros de forma de onda eléctrica. Para entregar ADN plasmídico a las células T de manera eficiente, las plataformas de nanovectores de ADN son una posibilidad de reducir el tamaño del plásmido mediante la eliminación de secuencias de ADN innecesarias, mientras que también agotan las secuencias CpG en el vector para reducir la toxicidad mediante la eliminación de un patrón molecular asociado a patógenos8,46.

La capacidad de generar un campo eléctrico variable en el tiempo arbitrario proporciona un espacio de parámetros casi ilimitado para optimizar el rendimiento. Utilizamos formas de onda bipolares para limitar el efecto de las reacciones electroquímicas que ocurren en el electrodo y limitar la acumulación de carga en los electrodos. La flexibilidad en el diseño de la forma de onda brinda la capacidad de adaptar la entrega a la carga en particular. Por ejemplo, existe evidencia de que la transferencia electroforética contribuye a la entrega de ADN plasmídico y ha llevado a la aparición de formas de onda con voltajes duales para mejorar el desempeño de la entrega23,25,26,47. De hecho, demostramos que una forma de onda de doble voltaje puede mejorar la eficiencia de la entrega de ADN plasmídico a las células Jurkat. También evaluamos el impacto de variar la amplitud de la forma de onda de voltaje, así como la frecuencia de la forma de onda y, por lo tanto, la cantidad de ciclos de forma de onda experimentados por las celdas de flujo. También se variaron la concentración de plásmido, las concentraciones de células y otros parámetros del proceso. El aumento de la concentración de carga o el aumento de la amplitud de la forma de onda de voltaje tendía a aumentar la eficiencia de transfección y reducir la viabilidad. Estos resultados son consistentes con numerosos estudios previos que documentan el equilibrio entre la eficiencia de transfección del ADN plasmídico y la viabilidad48,49.

En resumen, nuestros resultados demuestran las capacidades de nuestra novedosa plataforma de electroporación para la entrega de carga múltiple de alta eficiencia y alta viabilidad a Jurkat y células T primarias. Las innovaciones que ofrece nuestra plataforma de microfluidos y su rendimiento superior la convierten en un sistema prometedor para la reprogramación celular no viral para terapias celulares.

Los chips de flujo de electroporación se construyeron a partir de una pila de tres capas de sustratos poliméricos. Las tres capas se cortaron con láser con un punto de haz pequeño, láser de CO2 de alta resolución. Las capas superior e inferior, cortadas de losas acrílicas de 1 mm de espesor (McMaster Carr, Robbinsville, NJ, EE. UU.), crean el piso y las superficies de los canales de sellado. La capa intermedia era un espaciador que define la profundidad y el ancho del canal y estaba compuesta por una cinta adhesiva hidrófila sensible a la presión delgada. La hidrofilicidad del espaciador atrajo soluciones de base acuosa para evitar que el aire quedara atrapado durante el llenado del canal de microfluidos. Para fabricar el chip, las capas acrílicas inferior y superior se cortaron con láser en piezas de 1″ × 2″. Luego, las piezas se cortaron con láser para agregar puertos de entrada/salida de fluido y orificios de alineación para usar durante el proceso de ensamblaje. Cada pieza de acrílico se limpió con agua y luego con alcohol isopropílico. Posteriormente, se depositó una capa de adhesión de titanio delgada y un electrodo de película delgada de oro mediante deposición física de vapor usando un sistema de evaporación de cañón de electrones CVC SC4500 en la superficie interior de cada pieza de acrílico en el Cornell NanoScale Facility (CNF) usando una máscara. La capa intermedia se cortó a la medida y también recibió los orificios de alineación correspondientes mediante el proceso de corte por láser. Para evitar burbujas de aire durante el llenado de los canales de 10 mm de ancho, el canal se diseñó con una geometría cónica ensanchada en los puertos de entrada y salida de fluido. El conjunto sándwich de tres piezas (acrílico, película de polímero, acrílico) se unió luego por compresión en una prensa.

Las células T primarias se adquirieron de StemCell Technologies, que aisló células T pan de donantes normales mediante separación inmunomagnética negativa. Las células T primarias se cultivaron en medios ImmunoCult libres de productos animales complementados con 100 µg/mL de IL-2 humana recombinante (StemCell, Vancouver, BC, Canadá). Las células T primarias se descongelaron, se dejaron reposar durante la noche en medios y posteriormente se activaron con anticuerpos CD3/CD28 (StemCell) según las instrucciones del fabricante. Cuatro días después de la activación, se recogieron las células para la transfección. Las células Jurkat se compraron de Millipore Sigma (Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU.) y se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 % (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.). Todas las células se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2.

pCMV-GFP (ADN de plásmido; 3705 pb) se adquirió de Altogen Biosystems (Las Vegas, NV, EE. UU.). El ARNm de Dasher GFP (1 kb) se adquirió de Aldevron. SpCas9 y sgRNA dirigidos al locus TRAC o TRBC (TRAC: 5′-AGAGUCUCUCAGCUGGUACA-3′; TRBC: 5′-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3′) se compraron de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, EE. UU.). Los complejos de ribonucleoproteína (RNP) se formaron mezclando cantidades equimolares de SpCas9 y cada sgRNA e incubando durante 10 min a temperatura ambiente antes de agregarlas a las suspensiones celulares en tampón de electroporación.

Para los experimentos de electroporación, las células se recolectaron, contaron y lavaron dos veces en tampón de electroporación de baja conductividad BTXpress Cytoporation (Conductividad: 9 × 10–3 S/m; Holliston, MA, EE. UU.). Después del segundo lavado, las células se resuspendieron en el mismo tampón de electroporación a una densidad de 5 × 106 células/ml, a menos que se indique lo contrario. Posteriormente se añadió la carga a entregar en las concentraciones indicadas para cada experimento. Luego, las soluciones acuosas que contenían células y carga se cargaron en una jeringa, que luego se cargó en una bomba de jeringa (Chemyx, Stafford, TX, EE. UU.). Las suspensiones celulares se hicieron fluir continuamente en la celda de flujo a 320 µl/min (ancho de canal de 2 mm) o 1600 µl/min (ancho de canal de 10 mm) a menos que se indique lo contrario. A medida que las células transitan por debajo del electrodo, se sometieron a la forma de onda de voltaje arbitraria indicada generada por un generador de funciones (Siglent SDG 1032X; Siglent, Technologies, Solon, OH, EE. UU.) y amplificada por un amplificador de RF (TS250; Accel Instruments, Irvine, EE. UU.). CA, EE. UU.). A medida que las células salen de la salida, se distribuyen en pocillos que contienen medios celulares precalentados mediante un colector de fracciones robótico hecho a medida. El número de formas de onda que experimentan las células cuando pasan por debajo del electrodo se calcula como

mientras que la velocidad lineal de las células se calcula como

A lo largo de cada experimento, el generador de funciones y el osciloscopio se controlaron mediante un programa MATLAB personalizado para generar de una a diez formas de onda de voltaje arbitrarias preprogramadas durante la duración del experimento (v. 2021a, Mathworks, Natick, MA, EE. UU.). El cambio de forma de onda y el muestreador automático robótico se programaron para garantizar que cada pozo contuviera una población mayoritariamente pura de células que recibieran una forma de onda de voltaje preprogramada. Las formas de onda de voltaje y el voltaje a través de una resistencia de 1 Ω en serie con el chip de flujo fueron monitoreados por un osciloscopio (Siglent SDS1104X-E, Siglent Technologies). La eficacia de la transfección, la viabilidad celular y el rendimiento relativo se midieron 24 h después de la transfección (a menos que se indique lo contrario) mediante citometría de flujo.

Para los experimentos con Gene Pulser, las células se recolectaron, contaron y lavaron dos veces en tampón de electroporación Gene Pulser (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Después del segundo lavado, las células se resuspendieron en el mismo tampón de electroporación a una concentración de 5 × 106 células/mL. Posteriormente se añadió la carga a entregar en las concentraciones indicadas para cada experimento. Las soluciones acuosas que contenían células y carga se cargaron luego en una cubeta de 4 mm (Bio-Rad) y se pulsaron usando un sistema de electroporación Gene Pulser Xcell usando una sola onda cuadrada de 2 ms de 320 V para ARNm o 360 V para ADN plasmídico (Bio-Rad ). Después de pulsar, las células se transfirieron inmediatamente a una placa de 24 pocillos que contenía medios precalentados. La eficacia de la transfección y la viabilidad celular se midieron 24 horas después de la transfección mediante citometría de flujo.

Las células T primarias o Jurkat se retiraron 24 h (expresión de GFP) o 72 h (TCR-α) después de la transfección para el análisis de citometría de flujo utilizando un analizador de células ZE5 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). La expresión de TCR se midió mediante la tinción de células T primarias utilizando el anticuerpo anti-TCR humano AlexaFluor 488 a una dilución de 1:50 (BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.; número de catálogo 306712). La viabilidad se midió tiñendo las células con el tinte de viabilidad 7-AAD e incubando durante 5 min antes del análisis de flujo (Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.). Durante el análisis de flujo, las celdas se cerraron primero para excluir los desechos celulares utilizando gráficos de área de dispersión frontal (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) (morfología celular en la Fig. 3A, B). Posteriormente, las celdas individuales se bloquearon utilizando gráficos de área FSC y altura FSC. Para medir la viabilidad, se bloquearon células individuales para medir el porcentaje de poblaciones negativas (vivas) y positivas (muertas) de 7-AAD (viabilidad en la Fig. 3A, B). Para medir la expresión de GFP o TCR, las células viables se bloquearon para medir el porcentaje de células con fluorescencia verde en relación con los controles de voltaje cero (GFP en la Fig. 3A, B).

El número de experimentos independientes para cada conjunto de datos (n) se proporciona en las leyendas de las figuras. Todos los análisis y gráficos se completaron con GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, EE. UU.). Los datos se presentan como media ± desviación estándar.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente, HGC, previa solicitud razonable.

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Este trabajo se realizó en parte en Cornell NanoScale Facility (CNF), miembro de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (Grant NNCI-2025233).

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Jacob A. VanderBurgh, Thomas N. Corso, Stephen L. Levy y Harold G. Craighead

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Conceptualización: JAV, TNC, SLL, HGC; metodología: JAV, TNC, SLL, HGC; validación: JAV; análisis formal: JAV; investigación: JAV; redacción—borrador original: JAV; redacción—revisión y edición: JAV, TNC, SLL, HGC; visualización: JAV; supervisión: JAV, TNC, SLL, HGC; administración de proyectos: JAV, TNC, SLL, HGC; adquisición de fondos: TNC, SLL, HGC

Correspondencia a Harold G. Craighead.

JAV, TNC y HGC figuran como inventores en las solicitudes de patentes relacionadas con la tecnología presentada y JAV, TNC, SLL y HGC tienen un interés financiero en CyteQuest.

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Reimpresiones y permisos

VanderBurgh, JA, Corso, TN, Levy, SL et al. Plataforma escalable de electroporación de flujo continuo que permite la transfección de células T para la fabricación de terapia celular. Informe científico 13, 6857 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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Recibido: 26 julio 2022

Aceptado: 21 de abril de 2023

Publicado: 26 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33941-2

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