Mecanismos de cristalización de proteínas de membrana en 'bicelles'

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 11109 (2022) Citar este artículo

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A pesar del notable progreso, principalmente debido al desarrollo de LCP y la cristalización de 'bicelle', la falta de información estructural sigue siendo un cuello de botella en la investigación de proteínas de membrana (MP). Una de las principales razones es la ausencia de una comprensión completa del mecanismo de cristalización. Aquí presentamos estudios de dispersión de ángulo pequeño de la evolución de la matriz de cristalización "bicelle" en el curso del crecimiento de cristales MP. Inicialmente, la matriz corresponde al estado bicelle similar a un líquido. Sin embargo, después de agregar el precipitante, la matriz de cristalización se transforma en un estado gelatinoso. Los datos sugieren que esta fase final se compone de bicapas en forma de cinta interconectadas, donde crecen los cristales. Aparece una pequeña cantidad de fase multilamelar y su volumen aumenta concomitantemente con el volumen de los cristales en crecimiento. Sugerimos que la fase lamelar rodea los cristales y es fundamental para el crecimiento de cristales, que también es común para la cristalización de LCP. El estudio revela los mecanismos de cristalización MP "bicelle" y respaldará el diseño racional de la cristalización.

Las proteínas de membrana (MP) desempeñan un papel esencial en los procesos de las células vivas, como el transporte de iones a través de la membrana, la conversión de energía y la transducción de señales1,2. Un tercio del genoma humano codifica proteínas de membrana. Debido a su importante papel en la fisiología humana, las proteínas de membrana son el objetivo de aproximadamente el 60 % de los fármacos utilizados actualmente3,4. Hasta la fecha, el método más utilizado para obtener estructuras de proteínas de alta resolución es la cristalografía de rayos X, que requiere cristales de proteínas de alta calidad. Sin embargo, la cristalización de proteínas de membrana sigue siendo un gran desafío. Las estructuras únicas de proteínas de membrana5 representan solo ~ 1% de todas las estructuras de proteínas únicas de alta resolución disponibles6. Uno de los métodos in meso es la cristalización en una mezcla bicelar7,8,9,10,11. Sin embargo, este método conduce a la elucidación de varios MP importantes, cuyo mecanismo aún no está claro y solo se basa en ensayos y errores exhaustivos. El término "cristalización a partir de bicelas" puede relacionarse solo con el estado inicial de la matriz, y no se ha dilucidado la evolución del estado de bicela a una matriz capaz de soportar el crecimiento de cristales.

Se han realizado esfuerzos considerables para desarrollar nuevos métodos, materiales y herramientas que puedan ayudar a superar estos obstáculos. Sin embargo, a pesar de los intentos anteriores, la tasa de deposición de estructuras de proteínas de membrana (la primera estructura de proteína de membrana se depositó en 1985) todavía está lejos de las alcanzadas para las proteínas solubles.

Para superar el desafío, en 1996 se introdujo un nuevo método, es decir, la cristalización de MP en la matriz de fase cúbica lipídica (LCP). Este enfoque permitió la cristalización de MP desafiantes (p. ej., rodopsinas13,14,15 y receptores acoplados a proteína G) que han resistido la cristalización con los métodos estándar de difusión de vapor durante décadas16,17,18.

El enfoque de cristalización en meso se desarrolló aún más y se amplió con otros métodos y herramientas, por ejemplo, la utilización de lípidos con propiedades variadas para crear la matriz LCP19, la cristalización a partir de nanodiscos basados ​​en MSP20 o unidos a polímeros21,22, y la cristalización a partir de bicelas7,9 ,10.

Anteriormente, las bicelas se introdujeron como un modelo de imitación de membrana potencialmente superior a las micelas23. Se demostró que algunas mezclas de lípidos y detergentes forman partículas en forma de disco, con una bicapa lipídica, un núcleo y un borde estabilizado con detergente que proporciona un entorno estabilizador para las MP al imitar las membranas celulares nativas. La dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) se usa a menudo como un componente de fosfolípido de cadena larga de bicelas, y se puede dopar con fosfolípidos con longitudes de cadena similares pero diferentes grupos de cabeza. Por otro lado, el borde se puede estabilizar con un derivado de cadena corta de sal biliar como el 3-(colamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO). Dado que el fosfolípido de cadena larga en las bicelas está secuestrado en la región central plana, que carece de fosfolípidos de cadena corta o detergente, la región central de una bicela imita una sección de membrana natural mucho mejor que las micelas detergentes convencionales. El tamaño y las propiedades de estas partículas lipídicas pueden variar en función de la proporción de un lípido de cadena larga a un detergente o un lípido de cadena corta (relación Q) y la concentración de lípidos. La variación de Q proporciona una variedad de fases bicelle similares que son susceptibles de diferentes tipos de estudios biológicos. En general, con una proporción alta de lípidos (Q > 2) y un amplio rango de concentración (Clp = 0,25–25 % (p/p)), se forman bicelas con un diámetro de aproximadamente 100–500 Å24,25,26,27 ,28,29,30,31,32,33. La disminución de Q resulta en bicelas más pequeñas24,34,35,36.

Las mezclas bicilares muestran plasticidad estructural según la proporción (Q) de lípidos a detergente (o un lípido de cadena corta), la concentración de lípidos (Clp), la temperatura (T) y la composición química24,25,28,29,31,37,38 ,39,40,41,42,43,44,45.

En 2002, por primera vez, S. Faham y JU Bowie presentaron un nuevo método para cristalizar proteínas de membrana basado en sistemas de lípidos/detergentes formadores de bicelas7. Los cristales de bacteriorrodopsina (BR) obtenidos con este enfoque pertenecían al grupo espacial P21 con dimensiones de celda unitaria de a = 45,0 Å, b = 108,9 Å, c = 55,9 Å, β = 113,58°, y una unidad dimérica asimétrica y difractada a alta resolución. Se considera que los cristales de BR eran del tipo 1 con un típico empaquetamiento tipo sándwich de proteínas en forma de membrana, como es el caso de todos los cristales cultivados mediante el método LCP. Desde entonces, se han cristalizado varias proteínas de membrana importantes mediante este enfoque7,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63 ,64,65,66,67,68,69,70,71,72 (ver Tabla 1 y su versión extendida Tabla S1).

Contrariamente al paradigma dominante, nuestro análisis de los datos de la literatura muestra que las estructuras publicadas obtenidas con los cristales cultivados con el enfoque "bicelle" eran de ambos tipos (no solo cristales de tipo I típicos de la mesocristalización). Mientras que las proteínas integrales sin dominios solubles en agua suelen formar cristales de tipo I en forma de capa, las proteínas con regiones solubles en agua relativamente grandes (50 Å y más) tienden a formar cristales de tipo II. Sin embargo, los cristales de tipo I pueden formarse incluso en el último caso dependiendo de las condiciones de cristalización (ver Tabla S1). En particular, no existe una cierta dependencia del tipo de cristal en la composición de la solución precipitante. Puede significar que el cristal de proteína de membrana que crece desde el estado de bicela inicial puede pasar por rutas principalmente diferentes del estado estructural de la matriz de cristalización, dando como resultado dos tipos de cristales principalmente diferentes. El enfoque principal de este trabajo es el crecimiento de cristales de tipo I.

La morfología de los sistemas bicelle ha sido investigada por SAS, NMR, AFM y EM25,28,29,31,37,38,39,40,41,42,43,73. Para Q adecuado para la cristalización (alrededor de Q = 3), el diagrama de fase resumido tiene regiones específicas, que incluyen bicelas, fases nemáticas, como micelas ramificadas similares a gusanos o estructuras similares a cintas, estructuras multilamelares y membranas perforadas (ver Figura complementaria S1 (A)). Se sabe que el estado de fase de los sistemas lipídicos depende de la temperatura, lo que puede afectar la cristalización de proteínas74.

Curiosamente, aunque la dependencia del sistema con la temperatura es compleja, la mayoría de los cristales que crecieron con el método de las bicelas se obtuvieron a temperatura ambiente. En general, a bajas temperaturas y concentraciones de lípidos, el sistema es una suspensión líquida que contiene bicelas. A medida que aumentan la temperatura y la concentración Clp, el sistema forma estructuras similares a gusanos y cintas28,30,37,38,39,75,76. Un aumento adicional de la temperatura o la concentración provoca una transición a una fase de gel que consta de estructuras unilamelares o multilamelares y membranas perforadas24,28,29,37,38,39,75,77,78. Previamente se describió un sistema de DMPC/CHAPSO similar al utilizado en este estudio24. En un rango de temperatura desde la temperatura ambiente hasta los 32 °C, este sistema se compone de estructuras bicelladas y en forma de cinta, mientras que una parte del diagrama no se definió (Figura S1(B)).

La mayoría de los diagramas de fase publicados se obtuvieron para suspensiones acuosas puras de bicelas. En el caso de un experimento de cristalización, se agregan al sistema un precipitante y un MP, y su morfología puede cambiar. Se ha demostrado que el comportamiento de fase de la mezcla bicelar se ve afectado por la carga de la membrana y la salinidad del tampón. Por ejemplo, la alta salinidad promueve la vesiculación y la formación de agregados en sistemas DMPC/DHPC/DGPC cargados79. A su vez, la presencia de una carga en la membrana puede inducir la perforación de la bicapa lipídica24,30,80.

Por lo tanto, el término "cristalización a partir de bicelas" que se usa a menudo solo puede significar que la matriz de cristalización inicial es una fase líquida que comprende bicelas, proteínas de membrana (rodeadas de membranas nativas o sistemas que imitan membranas) y tampón. Sin embargo, no se sabe qué sucede con la matriz de cristalización después del inicio de la cristalización (al agregar el precipitante) y cuál es el estado de fase (estructura) cuando crecen los cristales.

Aquí, presentamos los resultados de los estudios de dispersión de neutrones y rayos X de ángulo pequeño (SAXS y SANS) de la evolución estructural de la matriz de cristalización desde la bicela inicial hasta el estado gelatinoso final donde crecen los cristales de MP. A valores bajos de Q, los anfífilos forman micelas81, mientras que, a medida que Q aumenta, tienden a formar bicelas. Para la cristalización de proteínas se utilizan las mezclas con Q = 2–3, y los anfífilos más utilizados son DMPC y CHAPSO (o DHPC) (ver la lista en la Tabla S1)7,46,47,48,49,50,51 ,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70.

El crecimiento de los cristales de proteína de membrana se controló simultáneamente en los mismos experimentos. El estado final (de gelatina) de la matriz, donde crecían los cristales, estaba formado por bicapas en forma de cinta interconectadas.

Para nuestro estudio, utilizamos un sistema de cristalización bien probado y condiciones en las que se observó previamente la formación de cristales de BR7,46. Los experimentos se dividieron en los siguientes cuatro pasos (Fig. 1A): (1) preparación del sistema de cristalización en hielo; (2) carga del sistema de cristalización en un capilar de vidrio; (3) adición de un precipitante y seguimiento en tiempo real de la evolución de la estructura de la matriz de cristalización; (4) seguimiento en tiempo real de la formación de cristales de bacteriorrodopsina en la matriz de cristalización.

Secuencia de los pasos experimentales. (A) Representación esquemática de las etapas experimentales de cristalización de bacteriorrodopsina en bicelas dentro de los capilares. Paso 1—preparación del sistema de cristalización en hielo (mezcla de bicelas y membranas moradas); paso 2: carga de la mezcla bicelar/membrana púrpura en un capilar; paso 3: adición de un precipitante y seguimiento de los cambios posteriores de la matriz de cristalización; paso 4: seguimiento de la formación de los cristales BR. Durante los pasos 2 a 4, se realizó el seguimiento de la estructura del sistema de cristalización y el crecimiento de los cristales mediante SAXS en tiempo real. (B)—Fotografías del sistema de cristalización en diferentes pasos de los experimentos (alineados verticalmente con A) correspondientes a los pasos 1 (día 0), 2 (día 4), 3 (día 8 y 17); el sistema de cristalización presenta una fase homogénea transparente/semitransparente. En el paso 4 (día 24, 25 y 65), aparecieron pequeños cristales que luego crecieron hasta su tamaño máximo.

Durante los pasos 2 a 4, el monitoreo del sistema de cristalización y el crecimiento de los cristales se realizaron con SAXS (Figs. 2, 3). Paralelamente, el sistema también se observó utilizando un microscopio óptico (Olympus SZX-ILLK200) (Fig. 1B).

Evolución de la matriz de cristalización durante el proceso de cristalización. Las curvas SAXS para la mezcla pura de DMPC/CHAPSO sin PM (izquierda) y el sistema de cristalización DMPC/CHAPSO/PM (derecha). Los datos experimentales para el sistema de cristalización con y sin PM se muestran como círculos huecos de color púrpura claro y naranja, correspondientemente. Las curvas SAXS para PM se muestran como cuadrados de color púrpura oscuro. Las aproximaciones por factores de forma de las bicelas y las cintas se muestran como líneas azules. Las representaciones gráficas de las organizaciones estructurales de la matriz de cristalización se muestran junto a las curvas SAXS correspondientes.

Transformación de las curvas SAXS para el sistema de cristalización durante los diferentes pasos del proceso de cristalización. (A) Las curvas SAXS relacionadas con diferentes pasos del proceso de cristalización. Las flechas rojas en la región del ángulo pequeño indican los picos de interferencia de la fase esméctica del lípido/detergente (las designaciones de las curvas se dan en la leyenda; la numeración de los pasos se describe en la Fig. 1). (B) Los picos extraídos de las curvas SAXS (parte A) por sustracción de la línea de base. Las curvas están escaladas para separarlas verticalmente para una mejor visualización. Las flechas negras "Lα1" y "Lα2" (que se muestran tanto en A como en B) indican los picos lamelares de primer y segundo orden; la otra flecha negra "Lcryst 64 Å" indica el pico de la fase lamelar local unida a la superficie de la proteína, el espaciado de este Lcryst es de 64 Å. La flecha "68 Å" indica el precursor de la fase Lcryst.

Además del sistema de cristalización que contenía proteína, también estudiamos (como referencia) el mismo sistema en las mismas condiciones, pero sin proteína. Los datos y los cálculos indican que la presencia de proteína no afecta la morfología de la matriz de cristalización. La relación calculada de BR a DMPC en nuestro sistema (la relación molar 1:200; la relación del área de la sección transversal en una membrana 1:17; el volumen 1:6) respalda nuestras conclusiones.

La preparación del sistema de cristalización (mezcla de proteína/bicela) se realizó en hielo de acuerdo con el procedimiento estándar descrito en la sección "Materiales y métodos". Vale la pena señalar que en lugar del BR solubilizado con detergente, usamos membranas moradas. Se supuso que el sistema presentaba una estructura bicelar ya que la mezcla DMPC/CHAPSO forma bicelas a bajas concentraciones y bajas temperaturas46. Para verificar esto, llevamos a cabo todos nuestros experimentos SAXS a temperatura ambiente; entre las mediciones SAXS, los capilares se mantuvieron en una caja de temperatura controlada a 32 °C. La concentración inicial de la mezcla DMPC/CHAPSO fue del 5,6 %, que también es lo suficientemente baja para las bicelas a temperatura ambiente. Usando el método de dispersión, observamos la formación de bicelas tanto en nuestro sistema puro (sin proteína) en un tampón apropiado (Fig. 2A) como en el sistema de cristalización en el paso 1, paso 2 (Fig. 2B).

El sistema de cristalización enfriado se transfirió al capilar (consulte "Materiales y métodos" y la Figura S2). Luego se estudió el sistema de cristalización por SAXS a temperatura ambiente. A modo de comparación, la suspensión de membrana púrpura se cargó en otro capilar. Esta suspensión contenía la misma concentración de proteína que el sistema de cristalización (8,4 mg/ml). Las curvas de dispersión para ambas muestras se presentan en la Fig. 2B. En la región de ángulo pequeño (hasta 0,04 Å−1), las curvas siguen un comportamiento lineal con una pendiente de −1,8 para el sistema de cristalización y −2,0 para las membranas moradas. Estas pendientes indican grandes estructuras laminares en las muestras, en nuestro caso, las membranas moradas. Restamos la intensidad de dispersión de las membranas moradas de la intensidad del sistema de cristalización. El resultado se muestra en la Fig. 2B (la curva está marcada como "intensidad de diferencia"). La diferencia de intensidad se puede ajustar mediante un factor de forma para las bicelas (Modelo 1) con un radio de 50 Å y una altura de 45 Å (consulte el ajuste en la Fig. 2B y los parámetros de ajuste en la Tabla S2). Además, examinamos la estructura de la matriz de cristalización bicelar pura en ausencia de membranas de color púrpura utilizando SAXS y SANS (consulte la sección "Materiales y métodos" para obtener más detalles). El sistema de cristalización presenta una mezcla bicelar con parámetros similares a los descritos en la Tabla S2, y las curvas de ajuste se presentan en la Fig. 2A (para el experimento SAXS) y la Figura S3 (para SANS). Los datos SAXS y SANS para estos sistemas son consistentes. Para ajustar los datos SAXS/SANS de las bicelas, utilizamos el Modelo 1 de un cilindro con un perfil de densidad de longitud de dispersión (SLD) de núcleo-capa, que se describe en "Materiales y métodos". Se utilizó con éxito un modelo similar en los estudios SAS anteriores de bicelas con diferentes contenidos de lípidos/detergentes44,82,83,84 (consulte también la sección "Perfiles SAXS para bicelas" en el Documento de texto S2).

En promedio, los radios del núcleo son de unos 40 Å; teniendo en cuenta el grosor de la correa, el diámetro total de la bicela es de ~ 100 Å (consulte la sección "Diferencias en los radios de la bicela" en el documento de texto S2). El diámetro de las bicelas observado en el trabajo24 para el sistema analógico (mezcla DMPC/CHAPSO, Q = 3) y obtenido mediante microscopía electrónica estuvo en un rango de 100-500 Å. De acuerdo con el ajuste de su modelo SANS, el diámetro era de aproximadamente 420 Å. Sin embargo, en el trabajo mencionado, la concentración total de lípidos/detergente fue de 0.25 % en peso, mientras que en nuestros experimentos estuvo en un rango de 5.6 a 14 %. Como se muestra en 38, el tamaño promedio de las bicelas depende críticamente de la concentración total de lípidos/detergente: el radio pseudohidrodinámico disminuye varias veces cuando la concentración total de lípidos aumenta varias veces. Por lo tanto, el diámetro de bicela de ~ 100 Å obtenido en nuestro estudio se alinea con los datos actuales sobre bicela.

Los conjuntos de datos correspondientes a la mezcla de bicelas con PM (es decir, el sistema de cristalización) en los pasos 1 y 2 podrían describirse como una suma de los datos de dispersión de PM y de bicelas puras (consulte la Fig. 2B y la sección "Ajuste de diferencia intensidades" en el documento de texto S2). Por lo tanto, podemos describir el sistema de cristalización antes de agregar un precipitante como una simple mezcla de bicelas y membranas púrpuras.

Después de cargar el sistema de cristalización (mezcla de membrana/bicela púrpura) en el capilar, se agregó un precipitante por encima de la mezcla de cristalización al mismo capilar con un espacio de aire entre el sistema de cristalización y el precipitante (consulte la sección "Experimental"). A partir de este momento, el volumen del sistema de cristalización comenzó a disminuir debido a la difusión de agua desde la matriz de cristalización hacia la solución precipitante. Después de una semana, el volumen disminuyó en un 50-60% y la semana siguiente correspondió al 40% del volumen inicial. Posteriormente, solo se observaron cambios menores. El diagrama de la disminución de la evaluación del volumen se presenta en la Figura S4.

La evolución de las curvas SAXS durante el paso 3 se presenta en la Fig. 3. Las curvas sufrieron cambios significativos y la matriz de cristalización tomó un estado transitorio. Entonces la matriz se estabilizó y no cambió su morfología. Este último estado es el foco de nuestro estudio exhaustivo, ya que muestra que los cristales comienzan a crecer en este estado de la matriz de cristalización.

Es importante tener en cuenta que los cambios cruciales en el perfil SAXS en las primeras etapas del Paso 3 (Fig. 2C, D) se deben principalmente a un aumento en la concentración de sal. Un búfer con una mayor concentración de sal tiene una mayor densidad de electrones (consulte la sección "Valores SLD del búfer en diferentes pasos" en el Documento de texto S2), razón por la cual la relación entre los contrastes Δρ = ρ – ρbúfer de los componentes bicelle cambia drásticamente con la concentración de sal , lo que lleva a una variación de la señal SAXS.

En esta etapa, como en el paso 2, el sistema de cristalización es una mezcla simple de bicelas y membranas moradas (ver Fig. 2D y Sección "Ajuste de intensidades diferentes" en el Documento de texto S2), pero su concentración es mayor debido a la evaporación del agua. del sistema de cristalización. Mientras tanto, los parámetros estructurales de las bicelas experimentan ligeros cambios (consulte la Tabla S2 y la Sección "Cambios SLD en bicelas" en el Documento de texto S2).

Con el secado continuado, el sistema sufre cambios morfológicos. Para la interpretación de la curva SAXS en la última etapa del paso 3 (Fig. 2E,F), nos guiamos por el diagrama de fase obtenido para la mezcla DMPC/CHAPSO en24, donde la relación molar Q = 3 estaba cerca de Q = 2.7 en nuestros experimentos. La temperatura y las condiciones de concentración en nuestros experimentos están marcadas con un rectángulo morado en el diagrama presentado en la Figura S1. Previamente, la reorganización de las bicelas en agregados alargados tipo cinta y gusanos fue detectada por diferentes métodos (SAS, microscopía electrónica, RMN, microscopía óptica polarizada)24,38,75,85,86. Dado que el DMPC tiende a formar una bicapa, estos objetos alargados "similares a gusanos" deben tener una sección transversal aplanada (como una cinta) con un grosor cercano al grosor de la bicapa de DMPC. Por lo tanto, para la aproximación de SAXS en las cintas, se utilizó el modelo de un cilindro elíptico con un perfil de densidad de longitud de dispersión de núcleo-carcasa (ver "Materiales y Métodos", Modelo 2). El modelo análogo del cilindro elíptico ya se utilizó en 24 para el ajuste de los datos SANS; sin embargo, en el trabajo mencionado, se supuso que el cilindro tenía la misma densidad, lo cual es suficiente para ajustar los datos de SANS. El caso de los datos SAXS requiere un modelo core-shell para aproximaciones teóricas porque las partes hidrofóbicas e hidrofílicas de las micelas y/o bicapas tienen un signo diferente de contraste Δρ = ρ – ρbuffer (ver, por ejemplo, la Tabla S3). De hecho, se observó que el grosor total de la cinta era ligeramente mayor que el grosor esperado de la bicapa de DMPC tanto en nuestros cálculos (ver Tabla S3) como en el trabajo24.

La formación de cintas a partir de bicelas está asociada con la redistribución de DMPC y las moléculas CHAPSO entre la cabeza y la región del cinturón de las bicelas, lo que resulta en la unificación de SLD y el grosor de la capa hidrofílica de la cinta. Por lo tanto, el grosor de la capa hidrófila resultante de la cinta se fija en el valor Tshell = Max (Hhead, ΔR) = ΔR = 11,4 Å.

Como las cintas se originan a partir de la fase bicelar inicial, esperamos la existencia de fases intermedias presentadas por bicelas y cintas. Esta suposición está de acuerdo con las regiones correspondientes del diagrama de fase de las bicelas (ver Figura S1B). Así observamos la coexistencia de bicelas y cintas en mezcla pura de DMPC/CHAPSO (sin PMs). La curva de dispersión de este sistema se aproxima con dos modelos: una cinta y una mezcla de cinta con bicelas. Los resultados de ambos enfoques se muestran en la Tabla S3 y la Fig. 2E. En general, los parámetros estructurales obtenidos no difieren drásticamente: la longitud de la cinta (L) es de aproximadamente 330 Å en ambos casos, los radios menor/mayor del núcleo hidrofóbico de las cintas son 25 Å/47 Å para el caso de la mezcla de cinta/bicela y 20 Å/43 Å solo para cintas (consulte la Tabla S3). Sin embargo, en el caso de la mezcla cinta/bicela, el valor de χ2 es mucho menor (1,2 en lugar de 3,5) y corresponde a una aproximación más precisa.

De acuerdo con los volúmenes de los núcleos hidrofóbicos de las cintas y las bicelas en el caso de la mezcla DMPC/CHAPSO (sin PM), en la etapa de formación de las cintas, para lo cual se obtuvo la curva de dispersión de la Fig. 2E , una cinta está formada por aproximadamente diez bicelas.

La curva SAXS (ver Fig. 2F) obtenida en las últimas etapas del paso 3 para el sistema de cristalización (DMPC/CHAPSO/PMs) contiene picos de difracción de las fases laminares Lα, Lcryst y la "fase 500–700 Å". En general, la curva de fondo aquí es similar a la curva de dispersión de las cintas en el caso de la mezcla DMPC/CHAPSO (ver Fig. 2E). En particular, el fondo se aproxima bien al factor de forma de las cintas (ver la línea continua en la Fig. 2F) y los parámetros estructurales obtenidos son similares a los obtenidos para las cintas en una mezcla "pura" de DMPC/CHAPSO (ver la Tabla S3). Por lo tanto, las cintas son el componente principal del sistema de cristalización en esta etapa del proceso de cristalización.

Es importante destacar que la curva de dispersión en esta etapa no sigue un comportamiento lineal con una pendiente de -2,0 típica de las estructuras achatadas. Esto podría implicar que los PM en su estado inicial están ausentes en esta etapa. Al menos, la concentración de los PM restantes no es suficiente para ser detectada por SAXS. Indica que la mayoría de los PM se disocia sincrónicamente con la transición de bicelas a cintas, y las moléculas de BR se incorporan directamente a las cintas. Teniendo en cuenta que la cantidad de membranas moradas es un orden de magnitud menor que la mezcla de DMPS/CHAPSO, asumimos que todas las membranas moradas deberían disolverse.

En los últimos pasos de cristalización, la matriz se estabilizó y las curvas SAXS no mostraron cambios significativos adicionales. En esta etapa se observan varios picos en las curvas SAXS (Figs. 2F y 3). Hay dos grupos de picos de diferente origen. Les damos las siguientes designaciones: 500–700 Å y Lα. El primer grupo presenta picos anchos en una región de ángulo pequeño q < 0,025 Å−1 (en la Fig. 3A, las curvas se indican como pasos 3.3 y 4.1; las flechas rojas indican los picos). Estos picos se observaron de uno a siete días antes y un día después de que se detectaran los cristales. Luego, estos picos desaparecieron a medida que los cristales comenzaron a crecer. Estos picos estuvieron acompañados por el otro grupo de picos lamelares Lα para 70–80 Å (se describirá en la siguiente subsección) o se observaron justo antes de que aparecieran estos picos lamelares Lα (consulte el Paso 3.3 en la Fig. 3A).

La primera posición del pico corresponde al parámetro de red d = 2π / qmax 500–700 Å (el valor promedio para la serie de muestras es 660 Å). El segundo pico correspondiente a d = 2π / qmax ~ 350 Å podría ser el pico de segundo orden del pico (660 Å) mencionado anteriormente; la relación de posición de pico varía de 1:1,79 a 1:1,89. O estos dos picos pueden tener orígenes diferentes ya que la proporción de las posiciones de los picos no es igual a 1:2. Vale la pena señalar que su apariencia está sincronizada (consulte la sección "Discusión"), y el parámetro de red d ~ 350 Å puede estar muy cerca de la longitud de la cinta. Desafortunadamente, no podemos sacar conclusiones sobre el origen de este pico ya que la longitud de las cintas no se puede estimar con precisión debido a la falta de disponibilidad de datos en el rango q correspondiente a la condición q L ≪ 1.

Dado que los picos de ángulo pequeño son transitorios, fue un desafío monitorear su comportamiento con la misma muestra. Solo tenemos dos curvas consecutivas que indican que el pico aumentó en su intensidad y su máximo se desplazó hacia ángulos más pequeños (resaltados por el rectángulo punteado en la Fig. 4). Nuestra discusión de la posible naturaleza de estos picos se da en la sección "Discusión".

SAXS alcanza su punto máximo en la fase de cristalización de lípidos/detergentes antes o en el momento de la formación de cristales. Las posiciones de los picos corresponden a distancias de 500 a 700 Å (estos valores se calcularon a partir de las posiciones de los picos de primer orden). Los gráficos se presentan después de la sustracción de la línea de base. Los picos observados desaparecieron varios días después de su aparición. Cada curva se mide en un capilar diferente. Las curvas están escaladas para separarlas verticalmente para una mejor visualización. El rectángulo punteado resalta dos curvas consecutivas de la misma muestra: estas curvas muestran que, con el tiempo, la intensidad máxima aumenta y cambia a ángulos más pequeños. Las flechas indican la posición de los picos de segundo orden.

El segundo grupo de picos corresponde a la fase lamelar Lα con el parámetro de red d = 70–80 Å. Hay dos picos de difracción laminar en el rango medio de los vectores de dispersión q (Fig. 3, indicados como "Lα1" y "Lα2"). La relación entre las posiciones máximas de los picos es de 1:2. Estos picos aparecieron antes de la formación de los cristales de BR y permanecieron en las curvas incluso después de la formación de los cristales durante todo nuestro período de observación (dos meses). Su intensidad aumentó y la posición del máximo cambió a mayor q durante el tiempo (Fig. 3B y Figura S5). Además, estos picos se observaron en las curvas de las muestras en las que no encontramos cristales de BR. Estudiamos el comportamiento estructural de la matriz lipídica pura en ausencia de BR en condiciones de cristalización y descubrimos que los picos laminares también se observaron allí en el último paso del secado de la matriz lipídica (Fig. 2G), lo que indica que la naturaleza de estos picos se originan en la matriz lipídica.

Estimamos las distancias lamelares d desde la posición del primer pico qm1 como d = 2π / qm1. Primero, cuando aparecieron los picos lamelares, correspondieron a la distancia de unos 84 Å, y luego, con el tiempo, a 73 Å. Estos valores se resumieron para un conjunto de muestras (13 elementos). La distancia de repetición d para la matriz lipídica sin BR corresponde a 74 Å. La transición de la mezcla bicelar a la fase lamelar se informó para los sistemas puros DMPC/CHAPSO y DMPC/DHPC a temperaturas crecientes24,25,29,31,73,87. Las distancias reportadas para las mezclas puras de DMPC/CHAPSO y DMPC/DHPC son alrededor de 62 Å y 65 Å respectivamente24,29, y para las vesículas multilamelares de DMPC puro son alrededor de 62 Å44,88. El mayor valor de 73 Å en nuestros experimentos puede deberse a la presencia de un tampón de alta concentración y moléculas BR.

Existe evidencia de que las mezclas bicelares pueden formar membranas perforadas24,37,38,39,75,80,89,90, donde los poros están bordeados por un detergente de cadena corta. SAXS es ​​incapaz de distinguir una bicapa homogénea de una perforada. Sin embargo, planteamos la hipótesis de que deberían existir supuestas perforaciones para conectar las membranas lamelares y ayudar a la proteína a migrar desde las bicapas al lugar del crecimiento de los cristales, que son las condiciones necesarias para el crecimiento de los cristales. Se planea seguir trabajando para obtener evidencia que respalde esta hipótesis.

Así, tras la adición del precipitado, el sistema de cristalización, que inicialmente es una mezcla de bicelas y membranas moradas, comienza a contraerse: aumenta la concentración de bicelas y membranas moradas. Luego, las bicelas se fusionan en cintas, este proceso se acompaña de la disolución de las membranas de color púrpura. También en este paso se observa la formación de una fase temporal con parámetros característicos de 500–600 Å. También se forma una fase multilaminar con unos parámetros de red medios de 73 Å. Esta fase permanece en el Paso 4, cuando se observa el crecimiento de cristales.

Cuando se estabilizó la matriz de cristalización, los cristales de BR comenzaron a crecer. Observamos la aparición de los cristales mediante un microscopio vis (ver "Materiales y métodos") en las muestras almacenadas a 32 °C de dos a tres semanas después del llenado capilar, y en cinco semanas, en las muestras almacenadas durante 4 semanas. a temperatura ambiente y luego se trasladó a una caja de temperatura controlada con una temperatura de 32 °C. En particular, el movimiento de las muestras a 32 °C aceleró la aparición de los cristales. El crecimiento de los cristales estuvo acompañado por picos de difracción que aparecían en las curvas de dispersión en el rango de gran angular (Fig. 3, pasos número 4) correspondientes a la red cristalina (ver más abajo). Las intensidades de los picos de cristal aumentaron a medida que crecían los cristales de proteína (ver Figura S5). Estos picos cristalinos siempre se observaron en presencia de los picos de fase lamelar Lα1, Lα2 como se mencionó anteriormente en una sección "Paso 3".

Se obtuvieron cristales de bacteriorrodopsina pertenecientes al grupo espacial P21 con dimensiones de celda unitaria de a = 45,0 Å, b = 108,9 Å, c = 55,9 Å, β = 113,58° mediante un método de cristalización de proteínas de membrana en sistemas 'bicelle' en el informe previamente informado. trabajo7. En nuestros experimentos de cristalización, se encontraron cristales con el mismo grupo espacial. Usando las posiciones de los picos (consulte la Tabla S4) obtenidas de los datos SAXS (consulte los datos iniciales y sustraídos en la Fig. 5A, B, correspondientemente) para la matriz de cristalización después de la formación de cristales, calculamos las dimensiones de la celda unitaria como a = 43.91 Å, b = 109,33 Å, c = 53,4 Å, β = 104,63°, que resultó estar cerca de los datos informados anteriormente7 (ver detalles del cálculo de las dimensiones de la celda unitaria en "Materiales y métodos").

Datos SAXS de la matriz de cristalización después de la formación de cristales (BM29, ESRF). (A) La curva SAXS para la matriz de cristalización con cristales (curva azul) y la línea base correspondiente (curva roja). (B) La curva SAXS de la matriz de cristalización después de la sustracción de la línea de base (naranja). La intensidad se multiplica por q4 para una mejor observación de los picos de gran angular. Las aproximaciones gaussianas de los picos se representan en negro. Los índices de Miller (para cristales BR) y los números de reflejo (para las multicapas lipídicas Lα o Lcryst) están marcados encima de los picos correspondientes (para obtener más detalles, consulte la Tabla S4).

Hay un pico de difracción a 63,9 ± 0,4 Å (valor promedio para siete muestras, 21 curvas) que no podemos asociar con los cristales BR ya que la posición de este pico de difracción está más allá de los parámetros del espaciado de la red BR. En los patrones 2D SAXS, este pico se presenta como reflejos puntuales (Fig. 6A). Por lo tanto, suponemos que este pico se puede atribuir a una fase lipídica cuasi-cristalina. Este pico siempre se observa en presencia de picos de Lα lamelares y, a veces, antes de que los cristales de BR puedan observarse mediante microscopía vis y SAXS. Su amplitud cambia concomitantemente con las intensidades de los picos de los cristales BR (Figura S5). Las posiciones del pico Lcryst y los picos de los cristales permanecen sin cambios dentro de sus barras de error durante el tiempo de observación. El pico descrito puede tener un "precursor": para varias muestras, pudimos registrar un pico en 68 Å (Figs. 3B y 6B), luego, después de varios días, cambió a 64 Å y retuvo esa posición. Se observó la misma posición a 68 Å para varias muestras en las que no registramos los cristales BR ni por microscopía vis ni por SAXS. En este caso, la posición del pico no cambió durante el tiempo de observación (60 días). El sistema de cristalización en estos casos contiene agregados de proteína sin formar, como se ve por microscopía vis (consulte la Figura S6 (A, B)). Suponemos que hay nucleación de lípidos y proteínas al comienzo de la formación de cristales; este núcleo tiene un espaciamiento característico de 68 Å reflejado en la aparición de un pico "precursor". Luego, un cristal comienza a crecer con un espacio de red fijo, y el pico observado cambia de 68 Å a 64 Å y ya no cambia esta posición durante el crecimiento del cristal. Sugerimos que el pico de 64 Å puede corresponder a la fase lipídica lateral local limitada físicamente con un cristal BR. Es similar al sistema lamelar descrito para la cristalización LCP17,91,92,93. Se describe la observación directa de la fase lamelar local en el caso de cristalización en LCP para BR93 y el péptido transmembrana DAP12-M94. Dado que esta fase lipídica local está unida físicamente al cristal, se espera que esté orientada en relación con el cristal. Además, es probable que los planos de las membranas sean paralelos a los planos de los cristales de "tipo I". La orientación de esta fase local implica que el pico "precursor" en la imagen de dispersión 2D está representado por un conjunto de picos de difracción separados, que se pueden observar en nuestros datos (ver Fig. 6A).

Comportamiento del pico para la fase lamelar local Lcryst. (A) Patrón 2D para la muestra que contiene los cristales BR (corresponde al paso 4.3 de la curva 1D en la Fig. 3). Las reflexiones correspondientes a la fase lamelar local Lcryst se muestran mediante flechas blancas. El anillo de dispersión pertenece a la fase multilaminar Lα con una separación de aproximadamente 84 Å. (B) Comportamiento del pico de la fase lamelar local Lcryst en las curvas 1D. Todas las curvas SAXS pertenecen a diferentes puntos de tiempo de la misma muestra. Las condiciones de cristalización son las mismas que para la muestra de la Fig. 3.

Así, después del equilibrio del sistema de cristalización, comienza la formación y el crecimiento de los cristales. En esta etapa, las cintas se presentan predominantemente, lo que podría ayudar a las proteínas a migrar a los centros de formación de cristales desde una fase multilamelar Lα con el parámetro de red 73 Å. También observamos la formación de la fase lamelar presumiblemente conectada directamente con la superficie del cristal (Lcryst) con el parámetro de red 64 Å. Esta fase podría permitir que las proteínas se difundan a la superficie del cristal.

Usando SAXS, investigamos la evolución estructural de la matriz de cristalización durante la cristalización de bacteriorrodopsina en la mezcla DMPC/CHAPSO, inicialmente en forma bicelar. Mostramos que en el paso inicial, la matriz presenta una mezcla de bicelas y membranas moradas. Así, inicialmente, la proteína no se incorpora a las bicelas, a diferencia de otros sistemas de cristalización, como LCP y vesículas, donde la proteína solubilizada en un detergente se agrega a LCP.

Al comienzo de la evaporación, las curvas SAXS muestran cambios significativos. Los cambios son causados ​​por el aumento de la concentración de sal y el correspondiente aumento de la densidad electrónica del tampón. Sin embargo, DMPC y CHAPSO todavía se ensamblan en bicelas.

En los siguientes pasos, en presencia de un precipitante y agua de evaporación de la matriz, esta última se transforma en una fase formada por estructuras en forma de cinta. En este paso, las curvas de dispersión no muestran cambios drásticos y, después de eso, se observa el crecimiento de los cristales. La fase es viscosa, lo que puede indicar ramificación e interconectividad de las cintas. La conexión de las cintas en una red continua debería facilitar la entrega de moléculas de proteína al sitio de nucleación y el crecimiento de cristales.

También es posible que las cintas se alineen en un paquete ordenado. Por lo tanto, los picos no cristalinos que aparecen en la curva de dispersión pueden interpretarse como un orden de corto alcance entre las cintas. Entonces, en la etapa similar a una cinta, los picos temporales se observaron en una región de ángulo pequeño de las curvas (q < 0.025 Å−1). Estos picos corresponden a los parámetros de espaciado de 270–350 Å y 500–700 Å para dos direcciones de ordenación. Hay dos posibles interpretaciones de lo que es esta fase de "500–700 Å". La primera interpretación es que estos picos corresponden a los parámetros de red 270–350 Å y 500–700 Å y pueden estar asociados con la formación de una fase colestérica formada por estructuras en forma de cinta. La suposición se basa en el hecho de que el parámetro de la red es mucho mayor que la longitud de la cinta (consulte la Tabla S3). En cuanto a la fase colestérica, los parámetros de la red de 500 a 700 Å corresponden al período de rotación a lo largo del eje director (la distancia sobre la cual se completa una rotación completa de 360°) conocida como pitch95. El segundo pico con un parámetro de red de 270–350 Å corresponde a la longitud de las cintas obtenidas de la aproximación de las curvas SAXS (consulte la Tabla S3 y la Fig. 2F), lo que puede indicar la orientación adicional de las cintas dentro de este hipotético colestérico. capas. La segunda interpretación es que estos picos con parámetros de red de 270–350 Å y 500–700 Å se pueden asociar con la formación de un esméctico formado por estructuras en forma de cinta. Los esmécticos se caracterizan por dos parámetros de orden: entre las capas y entre los elementos de una capa. En nuestro caso, las capas esmécticas podrían estar formadas por las cintas. El primer pico esméctico corresponde a una distancia de 500 a 700 Å entre las capas. El segundo pico corresponde a la distancia entre las cintas en una capa de 270 a 350 Å. La formación de las estructuras nemáticas y las micelas similares a gusanos ordenadas por orientación en las mezclas de DMPC/DHPC se mostró mediante microscopía óptica polarizada y dispersión de neutrones de ángulo pequeño (SANS)28,75,89. La referencia28 relacionada con la mezcla pura de DMPC/DHPC indica la aparición de un pico ancho en q ~ 0,015 Å−1 en las curvas SANS. Corresponde a unos 450 Å, que está cerca de nuestros parámetros. Además, la formación de micelas similares a gusanos ordenadas por orientación en las mezclas de DMPC/DHPC se demostró mediante diferentes métodos28,31,73,75,89,90.

La interpretación inequívoca de estos picos de 270–350 Å y 500–700 Å es imposible utilizando solo SANS y SAXS. Determinamos que las estructuras en forma de cinta son el componente dominante del sistema de cristalización; sin embargo, no está claro cómo se conectan las cintas y exactamente cómo se orientan entre sí. Para comprender los datos importantes de la fase, son deseables experimentos adicionales, en particular, un estudio complementario de microscopía electrónica. Independientemente de la verdadera naturaleza de estos picos, especulamos que la formación de tales estructuras ordenadas podría inducir el ordenamiento de proteínas en la matriz de cristalización y promover la cristalización de proteínas.

Luego observamos una fase multilaminar con un parámetro de distancia de 73 Å. La aparición y el crecimiento de cristales fueron detectados por SAXS y microscopía vis en los pasos cuando la fase multilamelar Lα también se estaba formando en la matriz. Esta evidencia destaca que la presencia de estructuras laminares extendidas es una condición importante para el crecimiento de cristales. Presumiblemente, esta fase acompaña al crecimiento de cristales similar al observado con cristales cultivados con LCP. Se asume que las estructuras similares a cintas son el componente dominante del sistema ya que las curvas SAXS presentan una buena aproximación por un factor de forma de las cintas.

Parece que la presencia de una fase lamelar local (Lcryst) unida a la superficie del cristal permite el crecimiento del cristal. La presencia de Lcryst se manifiesta por la aparición de picos de difracción en nuestras curvas de dispersión. En la nucleación cristalina, Lcryst tiene una distancia de 68 Å. Luego, durante la formación y crecimiento del cristal, este parámetro disminuye a 64 Å y mantiene este valor hasta el final de la observación (60 días). La proteína puede difundirse a la superficie del cristal a través de esta fase.

Por lo tanto, en contraste con el paradigma existente, nuestro estudio muestra que el estado gelatinoso de la matriz de cristalización 'bicelle', en lugar del bicelle inicial, es el estado donde crecen los cristales. Suponemos que estas estructuras laminares deben estar interconectadas para ayudar a las proteínas a migrar desde las bicapas al lugar de formación de cristales, que son las condiciones necesarias para el crecimiento de los cristales. Se planea seguir trabajando para obtener evidencia que respalde esta hipótesis.

Es importante destacar que, tras la formación de cristales, aparece una pequeña cantidad de fase multilamelar y su volumen aumenta concomitantemente con el volumen y el número de cristales en crecimiento. Por lo tanto, concluimos que la fase lamelar rodea los cristales y es fundamental para el crecimiento de los cristales, como también es común en la cristalización LCP17,91,92,93.

Resumimos toda la información disponible sobre la evolución de la matriz de cristalización que se ha mencionado en nuestro trabajo en el siguiente esquema de aparición/desaparición secuencial de varios elementos estructurales que se muestra en la Fig. 7. El proceso comienza con una fase fluida que contiene una mezcla simple de bicelas y membranas moradas. Inicialmente, la concentración de bicelas y PM aumenta debido a una disminución en el volumen de la matriz de cristalización al secarse (ver Fig. S4). Luego las bicelas se fusionan en cintas; este proceso va acompañado de la disolución del PM. Las cintas forman una fase gelatinosa, que es el principal componente de la matriz de cristalización durante la aparición y el crecimiento de los cristales de BR. Sin embargo, entre la aparición de cintas y cristales, aparecen varios tipos más de elementos estructurales: la fase lipídica lamelar Lα, la "fase 500–700 Å" y la fase lamelar local Lcryst. Lα corresponde a membranas lipídicas multilaminares que aparecen debido a la fusión de cintas. La cantidad de Lα aumenta (ver Fig. S5A) simultáneamente con una disminución lenta de la concentración de la cinta. Durante un tiempo mucho más largo que el crecimiento de los cristales (~ 100 días), las cintas pueden transformarse completamente en la fase Lα (ver Fig. 2G). Después de Lα, se detectó la "fase 500–700 Å". Esta estructura de alto orden tiene un parámetro de red igual o incluso mayor que la longitud de las cintas. Según la literatura28,31,73,75,89,90, tales estructuras pueden corresponder a esmécticas o colestéricas (nemática quiral). El papel exacto de esta estructura de alto orden en el proceso de cristalización de proteínas es cuestionable. La "fase 500–700 Å" aparece durante aproximadamente una semana y luego desaparece. Lcryst corresponde a membranas multicapa ubicadas en la superficie de los cristales de proteína y que permiten que la proteína se difunda a la superficie del cristal. En aquellas muestras donde se observó crecimiento de cristales, la aparición de Lcryst precede a la aparición de cristales, lo que indica que Lcryst también corresponde a las zonas de nucleación de proteínas. Luego, la intensidad de los picos I (q) de Lcryst y de los cristales crecen sincrónicamente (Fig. S5 (A)). Finalmente, aparecen cristales de proteína de membrana en la muestra de cristalización.

El esquema que demuestra la evolución de la matriz de cristalización y la aparición/desaparición secuencial de varios elementos estructurales: una mezcla de bicelas y PM, cintas, la fase lamelar Lα, la "fase 500–700 Å", la fase lamelar local Lcryst y cristales BR (ver descripción más amplia en el texto principal). Siguiendo a Katsaras et al.31, presentamos la "fase 500–700 Å" como nemática quiral; sin embargo, la verdadera naturaleza de esta fase aún no está clara. Los ejes corresponden al tiempo, la complejidad (es decir, el número/cantidad del nuevo elemento estructural aparecido) y la concentración, respectivamente. La concentración se da en unidades arbitrarias (los elementos estructurales tienen diferentes rangos de concentración; aquí la concentración se presenta en la misma escala para mayor claridad; las dependencias de las concentraciones frente al tiempo se muestran cualitativamente).

Nuestros resultados ayudan a arrojar más luz sobre la cristalización meso MP y, aunque quedan dudas, los resultados informados aquí respaldan firmemente el uso de este tipo de cristalización utilizando un diseño racional, haciéndolo considerablemente más eficiente. Este enfoque también podría ayudar con la cristalización eficiente de MP para el diseño de fármacos basados ​​en la estructura, el desarrollo de vacunas basadas en MP pertenecientes a diferentes patógenos, por ejemplo, SARS-CoV-2, y otras aplicaciones biomédicas.

El lípido 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) se adquirió de Avanti Polar Lipids Inc; El 3-([3-colamidopropil]dimetilamonio)-2-hidroxi-1-propanosulfonato (CHAPSO), el 2,5-hexanodiol y el trietilenglicol se adquirieron de Sigma-Aldrich.

La mezcla proteína/bicela se preparó según el procedimiento descrito previamente96. Se mezclaron CHAPSO y DMPC en una relación molar de 1:2,69 (CHAPSO:DMPC). A esta mezcla se le añadió agua desionizada (18,2 MΩ·cm) para conseguir una concentración final de bicelas del 35% (p/v). La mezcla se homogeneizó mediante enfriamiento cíclico en hielo, agitación en vórtex y calentamiento breve (a 40 °C). La mezcla preparada se almacenó a -20 °C.

Se purificaron membranas moradas que contenían bacteriorrodopsina (BR) a partir de células de Halobium Salinarum, como se describe en 97, y se concentraron hasta una concentración de BR de ~ 10 mg/ml. Se mezclaron membranas moradas enfriadas y solución de bicelas al 35 % en una proporción de 4:1 (v/v), se resuspendieron suavemente y se colocaron en hielo. La solución precipitante se añadió a la mezcla de membrana/bicelas en una proporción de 1:4 (v/v) de manera que la composición del tampón de la mezcla de proteína/bicelas fue NaH2PO4 0,49 M, hexanodiol 36 mM, trietilenglicol al 1,26 %. La solución precipitante contenía NaH2PO4 2,45 M, hexanodiol 180 mM, trietilenglicol al 3,5%, pH = 3,7. La solución final de proteína-bicela se incubó en hielo durante 30 min y se colocó en capilares. La mezcla final de proteína/bicela contenía 5,6 % de bicelas (concentración total de DMPC + CHAPSO) y 8–9 mg/ml de BR (estudiamos varias series de capilares).

Dado que las herramientas de cristalización estándar (como la gota sentada o la gota colgante) no son adecuadas para realizar experimentos de ángulo pequeño simultáneamente, desarrollamos un procedimiento de cristalización equivalente en capilares de vidrio.

El esquema de un capilar se presenta en la Figura S1. Se utilizaron capilares de vidrio de borosilicato con un diámetro exterior de 1,5 mm y un espesor de pared de 0,01 mm; la longitud de los capilares era de 80 mm. La transferencia del sistema de cristalización (mezcla BR/bicelle) a los capilares se realizó utilizando una aguja espinal con un diámetro exterior de 1,1 mm y una longitud de 90 mm. Antes de llenar el capilar, todos los materiales (capilares, agujas y soluciones) se enfriaron para asegurar la consistencia líquida de la suspensión de proteína-bicela.

La suspensión de proteína-bicela se colocó en el fondo del capilar. La solución precipitante se colocó en la parte superior de modo que se formara un espacio de aire de 6 a 8 mm entre la suspensión de proteína-bicela y la solución precipitante. El extremo del capilar se selló con cera (Figura S2 y Fig. 1).

Un lote de capilares se almacenó a 32 °C, el otro a temperatura ambiente. Notamos que los cambios en el sistema de cristalización eran muy lentos a temperatura ambiente debido a una pequeña área de evaporación que estaba limitada por el diámetro del capilar. Por lo tanto, después de 4 semanas colocamos todos los capilares en una caja de incubación a 32 °C. La cristalización se realizó a 32 °C. El crecimiento de los cristales se controló mediante un microscopio vis.

La mayoría de los experimentos SAXS se realizaron en un instrumento Rigaku en el Instituto de Física y Tecnología de Moscú (Dolgoprudny, Rusia)98. El instrumento Rigaku SAXS estaba equipado con una cámara estenopeica conectada a un generador de haz de alto flujo de rayos X de ánodo giratorio (MicroMax 007-HF) que operaba a 40 kV y 30 mA (1200 W). La longitud de onda de rayos X λ fue de 1,54 Å. Se colocó un detector Rigaku ASM DTR Triton 200 lleno de gas de cables múltiples (el diámetro del área activa es de 200 mm, el tamaño del píxel es de ~ 260 μm) a una distancia de 2,0 m de las muestras (el rango q cubierto es de 0,006–0,19 Å −1) y/o 0,5 m (0,024 Å−1 ≤ q ≤ 0,8 Å−1). La integración azimutal de las imágenes 2D obtenidas se realizó mediante el software Saxsgui (Rigaku Innovative Technologies, Inc., y JJ X-ray System Aps). Se realizó un experimento SAXS adicional para caracterizar celdas unitarias de cristales BR en una muestra en la línea de luz bioSAXS BM-29 en ESRF (Grenoble, Francia)99. La energía de trabajo de BM-29 (ESRF) fue de 12,5 keV, la cabina experimental estaba equipada con una mesa de mármol que albergaba un tubo de vuelo de longitud modular (distancia de muestra a detector de 3,5 m utilizada para este experimento), un detector 2D (Pilatus 1 M ), y un cambiador de muestras automatizado, y el rango de valores q alcanzable fue de 0,0025 a 0,5 Å−1. La recopilación de datos, el procesamiento y el análisis inicial se realizaron de manera automatizada utilizando BsxCuBE y el software de línea de luz dedicado dentro del marco EDNA100.

Las mediciones de SANS se realizaron en el momento YuMO de un espectrómetro de vuelo (IBR-2, Dubna, Rusia) con un sistema de dos detectores101,102. Las posiciones de los detectores estaban a 4,5 y 13 m de las posiciones de las muestras. Las longitudes de onda de neutrones utilizadas λ de 0,5 a 8 Å con el rango q alcanzable de 0,007 a 0,5 Å−1. El tratamiento de los datos brutos se procesó con el programa SAS103.

Para el recálculo de las dimensiones de la celda unitaria a partir de los datos SAXS, se minimizó la siguiente suma de cuadrados de las discrepancias relacionadas:

donde qexpi es la posición del i-ésimo pico experimental, qtheor ([hkl]i) es la posición teórica del pico que corresponde a los índices de Miller [hkl]i que dan la posición del pico más cercana a qexpi (consulte la Tabla S4). Las posiciones teóricas de los picos para un cristal con una celda unitaria monoclínica vienen dadas por la siguiente expresión (2):

El programa Primus del paquete de software ATSAS104 se utilizó para el procesamiento primario de los perfiles I(q) de SAXS y SANS 1D. Los datos de SAXS para soluciones acuosas de moléculas anfifílicas (liposomas unilamelares, bicelas, nanodiscos, micelas detergentes y proteínas de membrana solubilizadas) suelen demostrar que la intensidad máxima está en el rango de 0,1 a 0,2 Å-1 (ver, por ejemplo, la Fig. 2A), que es causado por fuertes faltas de homogeneidad en la densidad de electrones (las partes hidrofóbicas generalmente tienen un contraste negativo en relación con el solvente, mientras que las partes hidrofílicas tienen un contraste positivo). En los estudios de tales sistemas por SAXS, pueden surgir errores y ambigüedades si se utilizan modelos con perfiles homogéneos de densidad de electrones, como se mostró para el complejo de proteína de membrana NpSRII/NpHtrII solubilizado en un detergente105,106. Por lo tanto, la interpretación correcta de los datos SAXS de dichos sistemas requiere modelos con diferentes densidades de longitud de dispersión para diferentes partes de los objetos estudiados (en el caso de bicelas: un cinturón detergente, cabezas hidrofílicas y colas hidrofóbicas de la bicapa lipídica). Para ello se utilizaron dos modelos.

El modelo 1 (usado para las bicelas) es un cilindro circular con un perfil de densidad de longitud de dispersión de núcleo-capa (consulte la Fig. 8A, usamos un modelo de complemento basado en el modelo SasView del cilindro y core_shell_bicelle). De acuerdo con los datos previamente reportados para el modelo 3S de la bicapa DMPC107 (que es análogo a nuestro caso), se podría fijar el espesor de este núcleo (Htail) en un valor de 28.8 Å; de acuerdo con el área conocida por lípido, AL = 61,8 Å2, la SLD del núcleo hidrofóbico (ρtail) podría calcularse y fijarse (consulte la Tabla S3). El radio menor del cilindro del núcleo es R, la relación de radio mayor/menor ε = 1. Las caras del núcleo corresponden a las cabezas polares hidrofílicas de DMPC y las moléculas de agua unidas a las cabezas polares. El espesor de esta capa frontal (Hhead) es un parámetro de ajuste. Asumimos que la correa del cilindro está formada por CHAPSO. De acuerdo con el modelo atómico de la molécula CHAPSO108, el espesor de la correa ΔR en nuestros cálculos se fijó en el valor de 11,4 Å.

Modelos utilizados para la aproximación de los datos SAS. (A) Modelo 1: cilindro circular con un perfil de densidad de longitud de dispersión de núcleo-capa (en nuestros cálculos, usamos ε = 1 para las bicelas). (B) Modelo 2: cilindro elíptico con un perfil de densidad de longitud de dispersión de núcleo-capa.

El modelo 2 (usado para las cintas) es un cilindro elíptico con un perfil de densidad de longitud de dispersión de núcleo-carcasa (vea la Fig. 8B, usamos un modelo de complemento basado en dos modelos SasView de la categoría "cilindro": un cilindro_cáscara_núcleo y un cilindro_elíptico) .

El ajuste de las curvas SAS con los modelos de bicelas y cintas se realizó mediante el programa SasView 4.2.2109. La optimización de los parámetros estructurales en los modelos mencionados se realizó mediante la minimización de la siguiente expresión:

donde Nexp y Nparam son los números de los puntos experimentales y los parámetros ajustados, respectivamente; (qi, Ii, σi) es un conjunto de datos experimentales de SAS. Las ecuaciones (4–7) para la curva modelo Imodel(qi) se proporcionan en el Documento de texto S1.

Los cálculos se realizaron asumiendo que el factor de estructura puede despreciarse (S(q) = 1). Aunque las concentraciones de la muestra son altas (5,6–14 %) y es inevitable cierta influencia del factor de estructura en la curva de dispersión, esta influencia no es tan crítica para determinar el tipo de objeto, en particular, para distinguir entre las bicelas y las cintas, lo cual quedó demostrado en el trabajo (19). Sin embargo, los parámetros estructurales determinados durante el proceso de montaje pueden diferir de los reales. De hecho, no hay manera de tener en cuenta S(q) correctamente ya que no existen modelos teóricos apropiados. Es un gran desafío considerar el efecto del factor de estructura a concentraciones más bajas utilizando la dilución y siguiendo los experimentos SAXS, ya que la estructura de los objetos estudiados depende de la concentración y cambia con el tiempo. Así, los experimentos con otras concentraciones de muestra no permitirán obtener información sobre aquellos estados del sistema que se dan en experimentos reales de cristalización de proteínas de membrana y que se estudian en este trabajo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este manuscrito están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos al personal de ESRF y EMBL-Grenoble por su asistencia y apoyo en el uso de la línea de luz BM29. Agradecemos a Frank Laboratory of Neutron Physics (FLNP), JINR en Dubna (Rusia) por otorgar acceso al espectrómetro de dispersión de neutrones de ángulo pequeño YuMO (IBR-2).

TNM reconoce la concesión del Plenipotenciario rumano en el JINR dentro del Tema JINR 04-4-1142- 2021/2025 (#367/11.05.2021 ítem 17). Yu.LR y AVV agradecen el apoyo del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa (acuerdo 075-03-2022-107, proyecto FSMG-2021–0002). AVR reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa (acuerdo # 075-00958-21-05, proyecto #730000F.99.1.BV10AA00006). Los métodos de cristalización de proteínas se desarrollaron en el marco de la Fundación Rusa para la Investigación Básica (número de proyecto 19-29-12022). El procesamiento de los datos SAXS/SANS contó con el apoyo de la Russian Science Foundation (número de proyecto 21-64-00018).

Estos autores contribuyeron por igual: Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov y Yury L. Ryzhykau.

Laboratorio Frank de Física de Neutrones, Instituto Conjunto de Investigación Nuclear, 141980, Dubna, Rusia

Tatiana N. Murugova, Oleksandr I. Ivankov, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Daria V. Skachkova, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov y Alexander I. Kuklin

Centro de Investigación de Mecanismos del Envejecimiento y Enfermedades Relacionadas con la Edad, Instituto de Física y Tecnología de Moscú, 141700, Dolgoprudny, Rusia

Tatiana N. Murugova, Yury L. Ryzhykau, Dmytro V. Soloviov, Andrii V. Ishchenko, Andrey V. Rogachev, Alexey V. Vlasov y Alexander I. Kuklin

Universidad Nacional Taras Shevchenko, Kiev, 01033, Ucrania

Oleksandr I. Ivankov

Instituto de Problemas de Seguridad de las Centrales Nucleares de la NAS de Ucrania, Kyiv, 03028, Ucrania

Oleksandr I. Ivankov y Dmytro V. Soloviov

EMBL Hamburg Outstation, 22607, Hamburgo, Alemania

Kirill V. Kovalev

Anteriormente en EMBL-Grenoble Outstation, 38000, Grenoble, Francia

adán redondo

Instrumento de partículas individuales, agrupaciones y biomoléculas y cristalografía de femtosegundos en serie (SPB/SFX), European XFEL GmbH, 22869, Schenefeld, Alemania

adán redondo

Instituto de Procesamiento de Información Biológica (IBI-7: Bioquímica Estructural), Forschungszentrum Jülich, 52425, Jülich, Alemania

Christian Baeken y Oleksandr A. Volkov

JuStruct: Centro de Biología Estructural de Jülich, Forschungszentrum Jülich, 52428, Jülich, Alemania

Christian Baeken y Oleksandr A. Volkov

Instituto de Biología Estructural Jean-Pierre Ebel, Universidad de Grenoble Alpes–Comisariado de Energía Atómica y Energías Alternativas–CNRS, 38027, Grenoble, Francia

Valentín Gordely

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TNM, OII e YLR contribuyeron por igual y cualquiera tiene derecho a figurar en primer lugar en los documentos bibliográficos. Conceptualización: VIG, AIK; diseño de experimentos: VIG, AIK, TNM, OII, AVI, OAV, AVR; recolección de datos: TNM, OII, Dm.VS, Da.VS, AR, AIK; análisis e interpretación de datos: TNM, OII, YLR, Da.VS, VIG, AIK; Extracción de MP: CB; supervisión: VIG, AIK; redacción—borrador original: TNM, OII, YLR, KVK, AVV, AVI, AIK, VIG; redacción—revisión y edición: AR, VIG, AIK

Correspondencia a Tatiana N. Murugova, Alexander I. Kuklin o Valentin I. Gordeliy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Murugova, TN, Ivankov, OI, Ryzhykau, YL et al. Mecanismos de cristalización de proteínas de membrana en 'bicelles'. Informe científico 12, 11109 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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Recibido: 01 Marzo 2022

Aceptado: 31 de mayo de 2022

Publicado: 30 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13945-0

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