Evaluación de la penetración eléctrica de las membranas celulares usando cuatro - El lago de los cisnes Co., Ltd de Shijiazhuang

Microsystems & Nanoengineering volumen 8, Número de artículo: 68 (2022) Citar este artículo

1564 Accesos

4 citas

80 Altmetric

Detalles de métricas

La penetración eléctrica de la membrana celular es vital para determinar el interior de la célula mediante citometría de impedancia. Adjunto, proponemos un método para determinar la conductividad de la membrana celular a través de los niveles de inclinación de los pulsos de impedancia. Cuando ocurre la penetración eléctrica, una corriente de alta frecuencia pasa libremente a través de la membrana celular; así, la distribución intracelular puede actuar directamente sobre los pulsos de impedancia de alta frecuencia. La simulación numérica muestra que una distribución desigual de componentes intracelulares puede afectar los niveles de inclinación de los pulsos de impedancia, y los niveles de inclinación comienzan a aumentar cuando la membrana celular es penetrada eléctricamente. La evidencia experimental muestra que las frecuencias de detección más altas (>7 MHz) conducen a una distribución más amplia de los niveles de inclinación de los pulsos de impedancia cuando se miden poblaciones celulares con citometría de impedancia de cuatro frecuencias. Este hallazgo nos permite determinar que una frecuencia de detección de 7 MHz es capaz de atravesar la membrana de las células de Euglena gracilis (E. gracilis). Además, proporcionamos una posible aplicación de citometría de impedancia de cuatro frecuencias en el monitoreo de biomasa de células individuales de E. gracilis. Se puede aplicar impedancia de alta frecuencia (≥7 MHz) para monitorear estos cambios de biomasa, y se puede aplicar impedancia de baja frecuencia (<7 MHz) para rastrear los cambios de biovolumen correspondientes. En general, este trabajo demuestra un método de determinación fácil para la penetración eléctrica de la membrana celular, y la plataforma propuesta es aplicable para la evaluación multiparamétrica del estado celular durante el cultivo.

La evaluación de la biomasa de células individuales juega un papel vital en muchas áreas, incluido el análisis del estado celular1 y el mecanismo de crecimiento celular2, así como en cuestiones ambientales y energéticas3,4. Hasta la fecha, se han aplicado con éxito varias técnicas, incluidas imágenes de células vivas5, citometría de flujo Raman6 y sondas químicas7, para la evaluación de alto rendimiento de la biomasa intracelular en células individuales. Sin embargo, la mayoría de estos enfoques ópticos requieren mucho tiempo y mano de obra, y los estrictos requisitos para mantener y calibrar los puntos de enfoque del haz limitan su robustez y portabilidad. En este trabajo, propusimos un método más efectivo y conveniente para caracterizar la biomasa a través de las magnitudes de las señales de impedancia de alta frecuencia.

Como alternativa, se ha demostrado que la citometría de impedancia es aplicable para la caracterización de una sola célula de manera rentable y sin etiquetas8. Hasta la fecha, la citometría de impedancia se ha empleado con éxito para analizar la morfología9, la rigidez10 y los estados11 de células individuales. Se ha demostrado que la magnitud y la morfología de los pulsos de impedancia dependen del volumen12 y la forma13 de las células individuales, respectivamente. Además, la investigación ha encontrado que la detección de impedancia de alta frecuencia es aplicable para caracterizar las propiedades de la membrana14,15. Por ejemplo, la conductividad de la membrana celular aumenta al aumentar la frecuencia de detección por encima de 1 MHz14, y la conductividad de la membrana está relacionada con la viabilidad celular. Sui et al.16 y Zhong et al.17 han demostrado que una frecuencia de detección de 5–8 MHz es suficiente para permitir que la corriente atraviese las membranas de las células vivas de los mamíferos. Esta conclusión se extrae de las diferencias en la conductividad de la membrana entre células inactivadas y vivas. Sin comparación con células inactivadas, existen pocos informes de métodos aplicables para determinar directamente si la membrana es conductora.

Al medir la biomasa intracelular con citometría de impedancia, es necesario determinar la frecuencia de detección que puede penetrar la membrana celular. Nuestra solución es cuantificar el nivel de inclinación de los pulsos de impedancia como un índice de inclinación13 y luego evaluar la conductividad de la membrana celular a través del índice de inclinación de la población celular en diferentes frecuencias de detección. Con base en nuestro trabajo anterior, se encontró que la distribución del componente intracelular afecta el nivel de inclinación de los pulsos de impedancia de alta frecuencia (6 MHz)18,19 porque una corriente de alta frecuencia puede propagarse dentro de células individuales entre componentes intracelulares no conductores. Por el contrario, una corriente de baja frecuencia (500 kHz) no puede penetrar la membrana celular y se propaga principalmente alrededor de la célula18,19. Esta característica facilita un método novedoso para determinar la frecuencia de detección del interior y exterior de la celda en función del índice de inclinación de los pulsos de impedancia. Los interiores de las células son más heterogéneos que sus morfologías en una población. Cuando la frecuencia de detección es lo suficientemente alta como para penetrar la membrana celular, el índice de inclinación de los pulsos de impedancia para una población celular será más variado. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se utiliza el nivel de inclinación de los pulsos de impedancia para determinar la frecuencia de detección del interior de la celda.

En este trabajo, se empleó citometría de impedancia de cuatro frecuencias para analizar la conductividad de células individuales de Euglena gracilis (E. gracilis), como se muestra en la Fig. 1a. En primer lugar, se utilizó la detección de impedancia a diferentes frecuencias de células individuales de E. gracilis para determinar a qué frecuencia de detección la corriente podría pasar a través de la membrana celular. Cuando un campo eléctrico de alta frecuencia penetra la membrana celular, la distribución intracelular desigual inclina los pulsos de impedancia hacia la izquierda o hacia la derecha (ver Fig. 1b), que es un fenómeno que se ha verificado en simulaciones y experimentos. Además, se aplicó la técnica de citometría de impedancia de cuatro frecuencias propuesta (es decir, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz) para monitorear la biomasa de células individuales de E. gracilis de cultivos de cuatro días en diversas condiciones según la capacidad de impedancia de alta frecuencia para detectar biomasa intracelular. El escaneo eléctrico de las células de E. gracilis interna y externamente mostró claramente las respuestas celulares a diferentes medios de cultivo con fuentes orgánicas o iones inorgánicos, en los que las células exhibieron diferencias significativas en la multiplicación, el volumen y la opacidad. El volumen de las células individuales se controló mediante magnitudes de impedancia de baja frecuencia y sus cambios de biomasa se rastrearon mediante magnitudes de impedancia de alta frecuencia. El sistema de detección de impedancia se construyó en una placa de matriz de puertas programables en campo (FPGA) (ver Fig. 1c) con un amplificador de transimpedancia casero (ver Fig. 1d)20. Prevemos que el índice de inclinación puede facilitar un método alternativo para determinar la frecuencia de penetración eléctrica de las membranas celulares. Además, la plataforma propuesta basada en la impedancia se puede adoptar para evaluar los estados celulares y la biomasa, lo cual es fundamental en las aplicaciones prácticas que involucran cultivos celulares continuos21,22.

a Citometría de impedancia microfluídica para la detección de células de E. gracilis y algunas estructuras importantes de células individuales de E. gracilis. b Señales de impedancia en cuatro frecuencias distintas (es decir, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz) y el efecto de la distribución de componentes intracelulares en la morfología de las señales de impedancia de alta frecuencia. c Analizador de impedancia y (d) Respuesta de frecuencia del amplificador de transimpedancia de desarrollo propio

Para determinar la frecuencia de penetración de las células individuales, realizamos una simulación numérica 2D a través del módulo AC/DC del software COMSOL 5.6 Multiphysics (COMSOL Inc., Burlington, MA, EE. UU.). Aquí, las células de E. gracilis se simularon como elipses de una sola capa (radio: eje largo de 30 μm, eje corto de 10 μm) y la membrana celular (10 nm) se modeló utilizando la aproximación de impedancia de contacto23. Los componentes intracelulares se simplificaron como círculos 2D (espesor de membrana de 20 nm y diámetro de 1 μm) y se colocaron muy cerca del interior izquierdo de la célula18,19, como se muestra en la figura 2a. Otros parámetros de las celdas 18 utilizados en la simulación se enumeran en la Tabla S1 en la Información complementaria.

a Distribución de potencial eléctrico en seis frecuencias diferentes, incluidas 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 20 MHz y 100 MHz. La densidad de las líneas de corriente negras indica la densidad de corriente (A m−2). b Pulsos de impedancia simulados en las cuatro frecuencias de detección utilizadas en este trabajo. c–e Tres espectros simulados de frecuencias frente a (c) índice de inclinación, (d) ancho normalizado y (e) impedancia normalizada de los pulsos de impedancia. Tenga en cuenta que la magnitud de la impedancia y el ancho de los pulsos de impedancia se normalizaron en función de las métricas de impedancia de baja frecuencia.

En la detección de impedancia, la conductividad de la membrana celular depende de la frecuencia y, como se muestra en la Fig. 2a, la densidad de corriente dentro de la celda aumenta gradualmente al aumentar la frecuencia de detección. El paso continuo de corriente de alta frecuencia a través de la membrana celular muestra la aplicabilidad de la detección de impedancia de alta frecuencia para caracterizar los componentes intracelulares. En la simulación, la densidad de corriente creciente dentro de la celda indica la capacidad de fortalecimiento de la corriente de alta frecuencia para pasar a través de la membrana celular a medida que aumenta la frecuencia de detección.

La Figura 2b muestra los pulsos de impedancia inducidos en el mismo modelo de celda en cuatro frecuencias de detección. A medida que aumenta la frecuencia de detección, disminuye la resistencia del modelo de celda contra la propagación de corriente, lo que da como resultado magnitudes más pequeñas de los pulsos de impedancia. Además, los pulsos de impedancia correspondientes a celdas con formas simétricas a una frecuencia de detección baja (500 kHz) son simétricos. Por el contrario, el interior de la celda hueca derecha es responsable de inducir pulsos de impedancia asimétrica a altas frecuencias de detección. La mitad derecha de los pulsos de impedancia dura más que la mitad izquierda. Este fenómeno se puede cuantificar mediante el índice de inclinación, que se define como la relación de los lapsos de tiempo a cada lado del pulso de impedancia menos uno (ver Fig. 2b). Específicamente, el índice de inclinación es 0,009 para pulsos de impedancia simétrica a 500 kHz, mientras que es −0,201 para pulsos de impedancia asimétrica a 10 MHz. Se proporciona información más detallada sobre el índice de inclinación en la Fig. S1 en la información complementaria.

La figura 2c muestra la dependencia del índice de inclinación de la frecuencia de detección de 100 kHz a 100 MHz. Todos los índices de inclinación se comparan con el valor (cero) a una frecuencia de detección baja de 100 kHz. Un índice de inclinación creciente indica el impacto creciente de la distribución del componente intracelular en el nivel de inclinación de los pulsos de impedancia. A medida que aumenta la frecuencia de detección, la estructura interior del lado derecho de toda la celda inclina gradualmente los pulsos de impedancia hacia la derecha. Aproximadamente a 10 MHz, el índice de inclinación alcanza un valor extremo y, después de eso, los componentes intracelulares comienzan a ser penetrados eléctricamente (ver Fig. 2a). En comparación, el ancho y la magnitud de los pulsos de impedancia (ver Fig. 2d, e) contienen poca información sobre la distribución del componente intracelular. Ambos valores disminuyen al aumentar la frecuencia de detección debido a la disminución de la resistencia de la membrana celular, como se ha demostrado previamente en varios estudios8,24.

Los interiores de las células son más heterogéneos que sus morfologías en una población. Las estructuras internas heterogéneas hacen que el índice de inclinación se descentralice cada vez más cuando el campo eléctrico comienza a penetrar la membrana celular. Los resultados de la simulación de la dependencia de la frecuencia del índice de inclinación medido utilizando cuatro modelos diferentes, que incluyen perlas de 10 μm, celdas huecas, celdas huecas a la izquierda y celdas huecas a la derecha, se presentan en la Fig. 3a-c. A frecuencias de detección que oscilan entre 100 kHz y 100 MHz, la corriente no puede penetrar las perlas no conductoras. Por lo tanto, los pulsos de impedancia de las perlas siempre tienen una forma simétrica y los índices de inclinación permanecen en cero (ver Fig. 3b). Por el contrario, la forma de los pulsos de impedancia para las células huecas es asimétrica una vez que la corriente penetra en la membrana celular. Por ejemplo, a frecuencias de detección superiores a aproximadamente 100 kHz, el índice de inclinación comienza a aumentar desde cero y alcanza un valor máximo a aproximadamente 10 MHz. De acuerdo con este fenómeno, es posible que la propagación de corriente dentro de la celda pueda causar la forma asimétrica de los pulsos de impedancia.

a Análisis de distribución de potencial eléctrico en dos frecuencias diferentes, 500 kHz y 10 MHz, basado en cuatro tipos de modelos de simulación, que incluyen perlas de 10 μm, celdas huecas, celdas huecas a la izquierda y celdas huecas a la derecha. b Dependencia de frecuencia del índice de inclinación inducido por perlas de 10 μm y células huecas. c Dependencia de frecuencia del índice de inclinación inducido por los cuatro tipos de modelos de simulación. d, e Gráficos de violín de los resultados experimentales del índice de inclinación inducido por (d) perlas de poliestireno de 10 μm y (e) células de E. gracilis en 12 frecuencias de detección diferentes, incluidas 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz, 10 MHz, 11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz y 16 MHz

Además, cuando hay componentes dentro de la membrana celular, los niveles de inclinación de los pulsos de impedancia son más notorios que cuando el interior de la célula es hueco (ver Fig. 3c). Por lo tanto, el índice de inclinación causado por la membrana celular puede ignorarse para las células normales en la detección práctica, ya que siempre hay componentes intracelulares, como orgánulos o macromoléculas, dentro de la membrana celular. Además, el índice de inclinación muestra una dependencia de la distribución del componente intracelular con el aumento de la frecuencia de detección. Casi no hubo diferencia en los valores del índice de inclinación inducidos por el modelo de celda con hueco a la derecha o hueco a la izquierda, excepto por el signo. El índice de inclinación medido para un modelo de celda hueca izquierda siempre es positivo cuando la frecuencia de detección es suficiente para penetrar la membrana, ya que la estructura hueca izquierda hace que los pulsos de impedancia se inclinen hacia la izquierda. Para las celdas con huecos a la derecha, los índices de inclinación son siempre negativos. Antes de que los componentes intracelulares sean polarizados por campos eléctricos de alta frecuencia, la diferencia en el índice de inclinación inducida por los modelos de células huecas a la izquierda o huecas a la derecha aumenta gradualmente. Además, esta diferencia que se produce indica que la membrana celular es penetrada eléctricamente.

La Figura 3d, e ilustra los índices de inclinación inducidos por células de E. gracilis y perlas de 10 μm, respectivamente. Se utilizó citometría de impedancia de cuatro frecuencias para medir células individuales o partículas en 12 frecuencias de detección diferentes. Se realizaron tres mediciones independientes, aplicando el primer conjunto de frecuencias de detección dentro de 500 kHz (es decir, 100 kHz, 200 kHz, 300 kHz, 400 kHz), el segundo conjunto entre 500 kHz y 10 MHz (es decir, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz) y el tercero por encima de 10 MHz (11,5 MHz, 13 MHz, 14,5 MHz y 16 MHz). En el caso de las perlas de poliestireno no conductor, su índice de inclinación varió dentro de un rango estable cuando se aplicaron frecuencias inferiores a 13 MHz. Después de eso, una frecuencia de detección más alta resultó en una distribución más descentralizada del índice de inclinación. Esto puede deberse a que la frecuencia de detección (>13 MHz) supera el límite superior de nuestro sistema de detección de impedancia. Para las células de E. gracilis, el índice de inclinación comienza a descentralizarse a partir de 7 MHz; así, se produce la penetración eléctrica de la membrana celular. En comparación con el índice de inclinación de las perlas de poliestireno, la influencia del dispositivo se puede excluir cuando las frecuencias son inferiores a 13 MHz.

Al comparar las figuras 3c y e, podemos concluir que la creciente descentralización del índice de inclinación es indicativa de la penetración eléctrica de la membrana celular. En este trabajo, una frecuencia de 7 MHz es suficiente para penetrar la membrana celular para la detección de componentes intracelulares. Nuestros hallazgos anteriores también respaldan esta conclusión18,19.

Después de determinar la frecuencia de penetración eléctrica de la membrana celular, empleamos métricas de impedancia de baja frecuencia (es decir, 500 kHz y 4 MHz) para rastrear los cambios de volumen en las células de E. gracilis durante el cultivo fotomixotrófico, así como métricas de impedancia de alta frecuencia ( es decir, 7 MHz y 10 MHz) para monitorear la acumulación de biomasa. Cultivamos células de E. gracilis en medio Koren-Hutner (KH) durante cuatro días, y se usaron señales de impedancia para determinar la acumulación de biomasa de células de E. gracilis cultivadas fotomixotróficamente. La detección de impedancia de las células de E. gracilis se muestra en la película S1 y la figura S2 en la información complementaria. En este trabajo, se utilizó una frecuencia de detección máxima de 10 MHz, que funcionó bien dentro de nuestro sistema y también se usa comúnmente para el análisis del interior de la celda8. La frecuencia de detección más baja (500 kHz) se utilizó en nuestro trabajo anterior para caracterizar el volumen y la forma de las células individuales18,19. Las dos frecuencias medias, a saber, 4 MHz y 7 MHz, se seleccionaron en base a un espaciado de 3 MHz.

Las células de E. gracilis pueden proliferar rápidamente y acumular paramilón en cultivos fotomixotróficos mediante la fotosíntesis o la digestión de fuentes de carbono orgánico en el medio de cultivo (medio KH). Las células de E. gracilis cultivadas en medio KH durante cuatro días se ilustran en la Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, la cantidad de células de E. gracilis continuó aumentando durante cuatro días de cultivo, desde aproximadamente 241 células/μl hasta 1936 células/μl. Además, la biomasa de las células de E. gracilis aumentó rápidamente de 2,4 mg/mL a 8,5 mg/mL. La caída repentina en el día 3 puede deberse a un error de medición.

a Comparación del volumen de células de E. gracilis en experimentos de cuatro días. La barra de escala indica 10 μm. b Análisis estadístico de la proliferación celular y acumulación de biomasa de células de E. gracilis. c Evolución temporal de los cambios en los diámetros eléctricos de las células de E. gracilis en cuatro frecuencias de detección (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz). d Evolución temporal de los cambios en la opacidad eléctrica de las células de E. gracilis

Para la caracterización de impedancia de celdas individuales, que se muestra en la Fig. 4c, todas las propiedades dieléctricas de las celdas de E. gracilis se calibraron utilizando las propiedades dieléctricas de perlas de 10 μm. Durante un período de cultivo de cuatro días, el diámetro eléctrico de las células a 500 kHz aumentó de aproximadamente 10,89 a 11,46. Esto se debe a que el valor de la impedancia de baja frecuencia depende del volumen de la celda: un aumento en los diámetros eléctricos de baja frecuencia indica un aumento en el volumen de la celda8,18,19,24,25. En la frecuencia de detección más alta (10 MHz), la corriente puede penetrar libremente la membrana celular y propagarse en el citoplasma entre los componentes intracelulares (es decir, paramilón y cloroplastos), lo que permite relacionar el diámetro eléctrico de alta frecuencia con la biomasa intracelular no conductora de individuos. células. Por lo tanto, los aumentos en los diámetros de baja y alta frecuencia indican que hubo ligeros aumentos en el volumen y la biomasa durante los primeros 2 días.

En la Fig. 4d, la opacidad eléctrica de las células (Días 1 a 4) es casi idéntica a la de los precultivos (Día 0) ya que las nuevas condiciones de cultivo son las mismas que las de precultivo. Sin embargo, se produjo un aumento en el diámetro eléctrico de alta frecuencia (es decir, 7–10 MHz) el primer día, antes que el aumento en el diámetro eléctrico de baja frecuencia (es decir, 500 kHz) que se produjo el segundo día (ver Figura 4c). Esto puede deberse a que cuando las células de E. gracilis se transfirieron a un medio fresco, los nutrientes orgánicos adecuados y los iones inorgánicos indujeron la generación de componentes intracelulares antes de la multiplicación celular. En detalle, la tasa de proliferación de las células de E. gracilis puede ser acelerada por los iones Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+, Co2+ y Ni2+ en el medio26, y la multiplicación celular ocurre un poco más tarde que la multiplicación del cloroplasto. Para las células de E. gracilis, el número de cloroplastos en cada célula es relativamente estable, variando de 10 a 2027. Cuando hay 60 o más cloroplastos por célula, normalmente se produce la multiplicación celular28,29. Por lo tanto, las células de E. gracilis pueden tener una biomasa intracelular creciente antes de su multiplicación, lo que da como resultado un aumento ligeramente más temprano en los diámetros eléctricos de alta frecuencia en comparación con los diámetros eléctricos de baja frecuencia.

Aunque se requieren algunos iones metálicos inorgánicos para el crecimiento celular de E. gracilis y se estabilizan durante la síntesis de biomasa26,30, los suministros orgánicos pueden ser insuficientes en el entorno natural. Por lo tanto, las células de E. gracilis tienen que crecer fotoautotróficamente, y la mayor parte de su biomasa tiene que ser producida por fotosíntesis usando dióxido de carbono del aire como fuente de carbono31,32. Para analizar los efectos de los iones inorgánicos sobre el crecimiento celular y la acumulación de biomasa, se cultivaron células de E. gracilis en una solución de PBS 1x como control. Las propiedades dieléctricas, la multiplicación celular y la acumulación de biomasa de las células de E. gracilis cultivadas en medio PBS y Cramer-Myers (CM) se comparan y se muestran en la Fig. 5.

a Comparación del volumen de células de E. gracilis durante experimentos de cuatro días. La barra de escala indica 10 μm. b Análisis estadístico de la proliferación celular y acumulación de biomasa de células de E. gracilis. c Curso temporal de los cambios en los diámetros eléctricos de las células de E. gracilis en cuatro frecuencias de detección (500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz). d Evolución temporal de los cambios en la opacidad eléctrica de las células de E. gracilis

Sin fuentes de carbono orgánico en el medio de crecimiento, las células de E. gracilis cultivadas en medio PBS y CM durante cuatro días se muestran en la Fig. 5a. Debido a las fuentes limitadas de carbono en el aire, la síntesis de paramilón resultante estaba restringida. Por lo tanto, cuando las células de E. gracilis se transfirieron al medio CM y la solución de PBS, las células comenzaron a consumir energía almacenada (paramylon), lo que provocó una reducción de la biomasa. Además, el efecto de los iones inorgánicos sobre el crecimiento celular se muestra en la Fig. 5b. A pesar de las fuentes de carbono insuficientes, las células de E. gracilis en medio CM se dividieron con más frecuencia que las de la solución PBS. Este resultado también apoyó varias conclusiones de investigación con respecto a los efectos promotores de los iones inorgánicos en la multiplicación celular de E. gracilis33,34,35.

Aunque había más células en el medio CM que en el medio PBS, las biomasas de las células eran casi iguales en ambos casos. En otras palabras, las células individuales cultivadas en medio CM podrían tener menos biomasa que las células cultivadas en solución de PBS. Esta conclusión se confirmó aún más mediante la detección de impedancia, como se ilustra en la Fig. 5c. Después de cuatro días de cultivo, los diámetros eléctricos de las células de E. gracilis en solución de PBS fueron mayores que los de las células en medio CM en cuatro frecuencias de detección. Esto indicó que las células de E. gracilis en la solución de PBS tenían un volumen mayor debido a un mayor diámetro eléctrico de baja frecuencia y tenían componentes intracelulares más densos debido a una mayor opacidad eléctrica (ver Fig. 5d) en comparación con las células cultivadas en medio CM.

Además, los diámetros eléctricos y las opacidades eléctricas de las células también son buenos indicadores del cambio en el medio de cultivo. Cuando las células de E. gracilis se transfirieron a un medio de cultivo fresco, el diámetro eléctrico y la opacidad de las células, especialmente en solución de PBS, disminuyeron rápidamente el primer día de cultivo, lo que puede estar relacionado con los cambios en la ósmosis y el valor de pH de el medio de cultivo. Después de dos días de adaptación a estos nuevos entornos, la opacidad eléctrica y el diámetro de las células de E. gracilis volvieron a la normalidad.

Teniendo en cuenta las condiciones de crecimiento de las células de E. gracilis en medio CM, medio KH y solución PBS, concluimos que algunos iones inorgánicos pueden contribuir a la multiplicación celular. Especialmente cuando las células de E. gracilis se cultivan en un entorno con suficientes fuentes orgánicas e inorgánicas, su tasa de proliferación y la productividad de la biomasa celular alcanzan sus valores máximos. Los iones inorgánicos pueden acumularse en las células36,37 y la biomasa resultante es valiosa como fuente de biodiésel.

En este trabajo, propusimos un método que emplea la distribución del nivel de inclinación de los pulsos de impedancia para determinar si la frecuencia de detección es suficiente para penetrar las membranas celulares. A altas frecuencias de detección, la distribución del componente intracelular podría inclinar los pulsos de impedancia, lo que se ha verificado en simulaciones y experimentos. Los resultados experimentales mostraron que cuando ocurre la penetración eléctrica de la membrana celular, la distribución del índice de inclinación se descentraliza gradualmente a medida que aumenta la frecuencia de detección. La investigación ha encontrado que una frecuencia de detección de 7 MHz es suficiente para penetrar la membrana celular de las células de E. gracilis.

En las células vivas de E. gracilis, hay dos tipos de componentes intracelulares que representan la mayor parte de la biomasa, a saber, paramylon y cloroplastos. El paramilón, como fuente de biodiésel38,39, representa más del 50 % (p/p) del peso seco de las células individuales de E. gracilis40. Otra fuente de biodiesel es la membrana de los cloroplastos, que representa aproximadamente el 22% de la biomasa. Como alternativa ambientalmente benigna y sostenible, la energía de la biomasa ha despertado un interés considerable en las comunidades científica e industrial4,41. En Japón, por ejemplo, el biodiésel elaborado a partir de células de la microalga Euglena gracilis (E. gracilis) se ha utilizado en autobuses lanzadera y aviones comerciales como "combustible renovable de última generación"42. Dado que las células de microalgas son heterogéneas y su productividad de biomasa varía con sus condiciones de crecimiento, se necesitan técnicas eficientes para monitorear la acumulación de biomasa durante los procesos de cultivo. En este trabajo, nuestro estudio mostró que la citometría de impedancia es aplicable para analizar la morfología celular, así como los componentes intracelulares de las células de E. gracilis. Además, en el futuro se analizarán células de mamíferos y otros tipos de células que son importantes en los campos de la biomedicina y con respecto al medio ambiente.

Para los componentes intracelulares de las células de E. gracilis, las moléculas individuales de paramilón están recubiertas por una biomembrana y, a menudo, exhiben altos grados de cristalinidad, lo que teóricamente contribuye a la alta resistencia a la corriente33,43. Los cloroplastos son orgánulos de doble membrana que dan como resultado una mayor resistencia a la corriente a la misma frecuencia de detección en comparación con la de una célula de membrana única. Para la evaluación de la biomasa intracelular, es necesario determinar la frecuencia de detección a la que se puede detectar el interior celular. En este trabajo, informamos que 7 MHz es suficiente para penetrar la membrana celular de las células de E. gracilis. Sin embargo, aún se desconocen las propiedades dieléctricas de varios orgánulos y biomoléculas. Según el modelo numérico simplificado, los componentes intracelulares pueden polarizarse a 10 MHz, pero en los experimentos, esta frecuencia es insuficiente. En consecuencia, los parámetros dieléctricos de los componentes intracelulares requieren un estudio adicional para una simulación más precisa.

La citometría de impedancia multifrecuencia se ha empleado ampliamente en la detección y el análisis de células individuales5,8,44. Además, es bien sabido que los valores de impedancia de alta frecuencia están relacionados con los componentes intracelulares, ya que las corrientes de alta frecuencia pueden propagarse a través de la membrana celular24. Dado que la propagación actual no es visible en las celdas, carecemos de un método directo para determinar si la frecuencia de detección es aplicable para medir los componentes del interior de la celda. En este trabajo, propusimos que la distribución de componentes intracelulares se puede utilizar para determinar la penetración eléctrica de la membrana celular. Específicamente, cuando ocurre la penetración eléctrica de la membrana, la descentralización de la distribución del índice de inclinación aumenta al aumentar la frecuencia de detección. Esto se debe a que los interiores de las células son más heterogéneos que sus morfologías en una población. Las estructuras internas heterogéneas harían que el índice de inclinación se descentralizara cada vez más.

En este documento, empleamos la impedancia de baja frecuencia para realizar un análisis de rendimiento de la morfología y el volumen de las células individuales y la impedancia de alta frecuencia para caracterizar la biomasa intracelular. El mecanismo de detección está respaldado por numerosos trabajos anteriores. Nuestro trabajo anterior ha demostrado que la detección de baja frecuencia es aplicable para analizar la morfología celular, ya que la corriente de baja frecuencia se propaga principalmente alrededor de la celda13,18,19. También se ha verificado la dependencia de la impedancia de baja frecuencia con el volumen de la celda8. Además, se ha demostrado que la impedancia de alta frecuencia se puede utilizar para analizar la cantidad19, la distribución18 y la densidad19,45 de los componentes intracelulares. En este documento, el análisis de biomasa basado en la impedancia se basa en la aplicabilidad de la impedancia de alta frecuencia para monitorear la cantidad y la densidad de los componentes intracelulares, lo que también ha sido probado por resultados experimentales.

Por último, se ha demostrado que la plataforma propuesta basada en la impedancia es aplicable para evaluar los efectos de las condiciones de cultivo en el crecimiento celular de E. gracilis (volumen, opacidad y número) y la acumulación de biomasa. Las magnitudes de impedancia de alta frecuencia (≥7 MHz) se pueden aplicar para caracterizar la acumulación de biomasa, y las magnitudes de impedancia de baja frecuencia (≤4 MHz) permiten la cuantificación del volumen de células individuales. Los cambios en la acumulación de biomasa y el cultivo en diferentes medios se monitorearon con éxito durante cuatro días. En el futuro, sugerimos extender la aplicación del índice de inclinación a las células de mamíferos para rastrear los cambios en las propiedades de la membrana con respecto al envejecimiento celular, la carcinogénesis o la lisis.

Los experimentos se realizaron en células E. gracilis NIES-48 proporcionadas por la Colección de Cultivos Microbianos del Instituto Nacional de Estudios Ambientales (NIES, Japón). Los cultivos se cultivaron en tubos de cultivo cada uno con un volumen de trabajo de 13 mL bajo iluminación continua (blanco cálido, 130–150 μmol/m2/s) a 28 °C. Para estudiar los efectos de los nutrientes orgánicos sobre la biomasa y la metabolización de las células individuales, se cultivaron fotomixotróficamente células de E. gracilis utilizando medio KH (pH: 3,5)46. Para estudiar los efectos de los iones inorgánicos en el crecimiento celular, se cultivaron células de E. gracilis de forma fotoautotrófica utilizando medio CM (pH: 3,9)47. Las células de E. gracilis se cultivaron utilizando solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, pH: 6,9) como grupo de control. Los componentes detallados de los medios CM y KH fueron descritos por Wang et al.35. Brevemente, el medio CM no incluye ninguna fuente de carbono orgánico, mientras que el medio KH contiene glucosa y varios ácidos orgánicos y aminoácidos como fuentes de carbono48. Tanto el medio KH como el CM contienen altas concentraciones de iones inorgánicos, como Zn2+, Mn2+, Fe3+, Cu2+, Co2+ y Ni2+, algunos de los cuales pueden promover la acumulación de biomasa y la multiplicación de células de E. gracilis36,49.

Para la calibración se utilizaron perlas de poliestireno de 10 μm (Polysciences, EE. UU.) como partículas de referencia debido a sus propiedades físicas independientes de la frecuencia, que permiten considerarlas como perfectos aislantes. Teóricamente, las magnitudes de las cuatro impedancias de frecuencia de las cuentas deberían ser idénticas44.

Todas las muestras se transfirieron a PBS 1x y se inyectaron en dispositivos de microfluidos utilizando una bomba de jeringa (NIHON KOHDEN CFV-3200). La velocidad de flujo de la muestra fue de 4,5 μL/min, lo que resultó en un rendimiento de aproximadamente 1250 muestras/s para la detección de impedancia en este trabajo. En general, se realizaron tres réplicas de cada experimento, es decir, en la Fig. S3, había tres grupos de cultivo celular para cada estado de cultivo celular.

Los experimentos se realizaron durante un período de 4 días (es decir, de 0 a 4 días) para el medio CM, el medio KH y la solución 1xPBS, y cada grupo contenía tres cultivos independientes de E. gracilis para una caracterización sólida. El crecimiento de las células de E. gracilis se analizó según el número de células, el peso seco, el volumen celular y la opacidad. Aquí, el peso seco de las células de E. gracilis se determinó utilizando 0,4 ml de cultivos que se habían secado a 100 °C durante más de 4 h50. El volumen de las células se determinó usando diámetros eléctricos de baja frecuencia (\(\left| {Z_{LF}} \right|^{1/3}\)), y el volumen de los componentes intracelulares se determinó usando alta frecuencia diámetros eléctricos (\(\left| {Z_{HF}} \right|^{1/3}\))18. Los cambios de color en los tubos de cultivo durante cuatro días se muestran en la Fig. S3 en la información complementaria, y el color verde en los tubos de cultivo se vuelve más oscuro a medida que aumenta la cantidad de células.

El microcanal de polidimetilsiloxano (PDMS) en el área de detección tiene 40 μm de ancho y 35 μm de profundidad. El canal se coloca sobre dos pares de electrodos coplanares, cada par consta de una fuente y un electrodo de detección (dimensiones: 30 μm de ancho, 30 μm de extensión de borde a borde y 80 μm de extensión de par). Cada electrodo está recubierto con una capa de oro (Au) de 70 nm de espesor sobre una capa de cromo (Cr) de 70 nm de espesor. El procedimiento completo de fabricación se describió en detalle en nuestro trabajo anterior13,18.

Como se muestra en la Fig. 1c, se usó un amplificador de bloqueo basado en matriz de puertas programables en campo (FPGA) (Diligent Eclypse Z7, EE. UU.) para generar una señal de corriente alternativa (CA) de 1 V en cuatro frecuencias de detección (es decir, 500 kHz, 4 MHz, 7 MHz y 10 MHz) y realizar el procesamiento en tiempo real de las señales de impedancia13,20 del área de detección. Las señales de corriente de dos electrodos de detección se convirtieron en señales de voltaje con amplificadores de transimpedancia de desarrollo propio (convertidores I/V) y luego se compararon con amplificadores diferenciales (Diff). El voltaje diferencial resultante se procesó aún más en la placa FPGA para obtener las señales de impedancia correspondientes. Todas las señales de impedancia se registraron a una frecuencia de muestreo de 62,5 kHz mediante un dispositivo de recopilación de datos (USB-6363 BNC, National Instruments, EE. UU.) y se visualizaron en tiempo real en una computadora a través de NI DAQExpress (National Instruments, EE. UU.). Los pasos experimentales para usar este dispositivo para la detección de impedancia se muestran en la Fig. S4 en la información complementaria. En la Fig. 1d, la respuesta de frecuencia del convertidor I/V muestra su capacidad para convertir de manera estable señales de corriente de hasta 18,48 MHz. Cuando la frecuencia de detección fue superior a 10 MHz, el factor de amplificación (ganancia) comenzó a disminuir.

Las señales de impedancia se procesaron mediante scripts personalizados escritos en MATLAB (versión 2021b, MathWorks, EE. UU.). La impedancia (|Z|) de cada perla o célula de E. gracilis se determinó mediante un ajuste gaussiano de un solo pico para extraer la amplitud máxima de la señal para cada frecuencia aplicada. Las magnitudes de impedancia media de las perlas de 10 μm a cuatro frecuencias se determinaron automáticamente y luego se usaron para calibrar los diámetros eléctricos de las células de E. gracilis. La opacidad eléctrica media (|ZHF|/|Z500kH|) y el diámetro (\(\left| Z \right|^{1/3}\)) de las células de E. gracilis se normalizaron utilizando multiplicadores lineales simples para garantizar que la media los valores de ambos parámetros de impedancia de las perlas tenían una opacidad = 1 y un diámetro = 10 en cada frecuencia. Además, la morfología y la distribución intracelular de las células de E. gracilis se pueden evaluar a frecuencias bajas y altas, respectivamente, usando el índice de inclinación (TLeft⁄TRight − 1) comparando el lapso de tiempo de la mitad izquierda y derecha (TLeft⁄TRight ) de los pulsos de impedancia18.

Zangle, TA, Burnes, D., Mathis, C., Witte, ON y Teitell, MA Cuantificación de cambios en la biomasa de células T CD8+ individuales durante la citotoxicidad específica de antígeno. PLOS UNO 8, e68916 (2013).

Artículo Google Académico

Rhind, N. Control del tamaño de las células. actual Biol. 31, R1414–R1420 (2021).

Artículo Google Académico

Petrus, L. & Noordermeer, MA De biomasa a biocombustibles, una perspectiva química. Verde. química 8, 861–867 (2006).

Artículo Google Académico

Sindhu, R. et al. Producción de biocombustibles a partir de biomasa: hacia el desarrollo sostenible. Desarrollos Actuales en Biotecnología. y Bioeng: Tratamiento de Residuos. Procesos para la Generación de Energía 79–92 (2019) https://doi.org/10.1016/B978-0-444-64083-3.00005-1.

Mikami, H. et al. Citometría de flujo de imágenes de fluorescencia de congelación virtual. Nat. común 11, 1162 (2020).

Artículo Google Académico

Gala de Pablo , J. , Lindley , M. , Hiramatsu , K. & Goda , K. Citometría de flujo raman de alto rendimiento y más allá. Cuenta química Res. 54, 2132–2143 (2021).

Artículo Google Académico

Ota, N. et al. Aislamiento de células individuales de euglena gracilis mediante microfluidos de vidrio para el análisis raman de la biogénesis de paramylon. Anal. química 91, 9631–9639 (2019).

Artículo Google Académico

Honrado, C., Bisegna, P., Swami, NS y Caselli, F. Citometría de impedancia microfluídica de una sola célula: desde señales sin procesar hasta fenotipos celulares mediante análisis de datos. Laboratorio en un chip (2021) https://doi.org/10.1039/d0lc00840k.

Zhong, J., Liang, M. & Ai, Y. Caracterización de partículas con precisión submicrónica en citometría de impedancia microfluídica con electrodos diferenciales dobles. Laboratorio en un chip (2021) https://doi.org/10.1039/D1LC00481F.

Kim, J., Li, B., Scheideler, OJ, Kim, Y. & Sohn, LL Visco-node-pore sensing: una plataforma de reología microfluídica para caracterizar las propiedades viscoelásticas de las células epiteliales. iScience 13, 214–228 (2019).

Artículo Google Académico

Haandbæk, N., Bürgel, SC, Rudolf, F., Heer, F. & Hierlemann, A. Caracterización de fenotipos de células de levadura individuales mediante citometría de impedancia microfluídica e imágenes ópticas. ACS Sens. 1, 1020–1027 (2016).

Artículo Google Académico

Petchakup, C., Li, H. & Hou, HW Avances en citometría de impedancia de células individuales para aplicaciones biomédicas. Micromachines (Basilea) 8, (2017).

Tang, T. et al. Citometría de impedancia microscópica para cuantificar la forma de una sola célula. Biosens. y Bioelectrón. 113521 (2021) https://doi.org/10.1016/j.bios.2021.113521.

Xu, Y. et al. Una revisión de las mediciones de impedancia de células enteras. Biosens. Bioelectrón. 77, 824–836 (2016).

Artículo Google Académico

Zhao, Y. et al. Desarrollo de citometría de impedancia microfluídica que permite la cuantificación de la capacitancia de membrana específica y la conductividad del citoplasma de 100 000 células individuales. Biosens. Bioelectrón. 111, 138–143 (2018).

Artículo Google Académico

Sui, J., Foflonker, F., Bhattacharya, D. y Javanmard, M. La impedancia eléctrica como indicador de la salud de las células de microalgas. ciencia Rep. 10, 1–9 (2020).

Artículo Google Académico

Zhong, J., Li, P., Liang, M. y Ai, Y. Ensayo de viabilidad celular sin etiquetas y enriquecimiento de células crioconservadas mediante citometría microfluídica y clasificación bajo demanda. Adv. Mate. Tecnología 2100906 (2021) https://doi.org/10.1002/ADMT.202100906.

Tang, T. et al. Ensayos de impedancia de doble frecuencia para componentes intracelulares en células de microalgas. Laboratorio en un chip (2022) https://doi.org/10.1039/D1LC00721A.

Tang, T. et al. Seguimiento basado en la impedancia de la pérdida de componentes intracelulares en células de microalgas. Sens. Actuadores B: Chem. 358, 131514 (2022).

Artículo Google Académico

Tang, T. et al. Citometría de impedancia no paralela asistida por FPGA como sensor de ubicación de una sola partícula. en 2021 21ª Conf. Internacional. sobre sensores de estado sólido, actuadores y Microsyst. (Transductores) 727–730 (IEEE, 2021). https://doi.org/10.1109/Transducers50396.2021.9495657.

Fernandez-de-Cossio-Diaz, J. & Mulet, R. Máxima entropía y heterogeneidad poblacional en cultivos celulares continuos. PLOS Computacional Biol. 15, e1006823 (2019).

Artículo Google Académico

Thuronyi, BW et al. Evolución continua de los editores básicos con mayor compatibilidad de destino y actividad mejorada. Nat. Biotecnología. 2019 37:9 37, 1070–1079 (2019).

Google Académico

Gong, L. et al. Supervisión directa y sin etiquetas del estado celular de esferoides y microportadores mediante citometría de impedancia microfluídica. Pequeño 17, 2007500 (2021).

Artículo Google Académico

Sun, T. & Morgan, H. Citometría de impedancia microfluídica de una sola célula: una revisión. Microfluídica Nanofluídica 8, 423–443 (2010).

Artículo Google Académico

Han, X., van Berkel, C., Gwyer, J., Capretto, L. y Morgan, H. Lisis microfluídica de sangre humana para el análisis de leucocitos mediante citometría de impedancia de células individuales. Anal. química 84, (2012).

Ochi, H. Requerimiento y acumulación de iones inorgánicos en Euglena gracilis ZJ Jpn. Soc. Nutrición ciencia de la comida 43, 54–57 (1990).

Nigon, V. & Heizmann, P. Morfología, bioquímica y genética del desarrollo de plástidos en Euglena gracilis. en 211-290 (1978). https://doi.org/10.1016/S0074-7696(08)62243-3.

Cook, JR Crecimiento desequilibrado y replicación de poblaciones de cloroplastos en Euglena gracilis. J. Gen. Microbiol. 75, 51–60 (1973).

Artículo Google Académico

DAVIS, E. & EPSTEIN, H. Algunos factores que controlan la variación gradual del número de orgánulos en Exp. Resolución celular 65, 273–280 (1971).

Artículo Google Académico

Khatiwada, B. et al. Sondeando el papel de los cloroplastos en la tolerancia y acumulación de metales pesados en Euglena gracilis. Microorg. 8, 115 (2020).

Artículo Google Académico

Yan, R., Zhu, D., Zhang, Z., Zeng, Q. y Chu, J. Metabolismo del carbono y conversión de energía de Synechococcus sp. PCC 7942 en condiciones mixotróficas: comparación con condiciones fotoautotróficas. Aplicación J. Phycol. 4, 657–668 (2012).

Artículo Google Académico

Beardall, J. & Raven, JA Límites del crecimiento fototrófico en cultivo denso: suministro de CO2 y luz. Algas para biocombustibles y energía. 91–97 (2013) https://doi.org/10.1007/978-94-007-5479-9_5.

Gissibl, A., Sun, A., Care, A., Nevalainen, H. & Sunna, A. Bioproductos de Euglena gracilis: síntesis y aplicaciones. Frente. en Bioingeniería y Biotecnología. 7, 2296–4185 (2019).

Einicker-Lamas, M. et al. Euglena gracilis como modelo para el estudio de la toxicidad y acumulación de Cu2+ y Zn2+ en células eucariotas. Reinar. contaminar 120, 779–786 (2002).

Artículo Google Académico

Wang, Y., Seppänen-Laakso, T., Rischer, H. & Wiebe, MG Euglena gracilis crecimiento y composición celular bajo diferentes condiciones de temperatura, luz y tróficas. PLoS ONE 13, 1–17 (2018).

Matsumoto, T., H. Inui, K. Miyatake, Nakano, Y. y Murakami, K. Comparación de nutrientes en Euglena con los de otras fuentes de alimentos representativas. Eco-Ing. 21, 81–86 (2009).

Google Académico

Guedes, AC & Malcata, FX Valor nutricional y usos de microalgas en acuicultura. Acuicultura 10, 59–78 (2012).

Google Académico

Matos, A. P. El impacto de las microalgas en la ciencia y tecnología de los alimentos. Mermelada. Sociedad de Químicos del Petróleo. 94, 1333–1350 (2017).

Artículo Google Académico

Furuhashi, T. et al. Perfil de éster de cera y compuesto lipofílico de Euglena gracilis por cromatografía de gases-espectrometría de masas: hacia la comprensión de la fermentación de éster de cera bajo hipoxia. Metabolómica 11, 175–183 (2014).

Artículo Google Académico

Sun, A., Hasan, MT, Hobba, G., Nevalainen, H. y Te'o, J. Evaluación comparativa de Euglena gracilis var. cepa variante de saccharophila como productora del paramylon β-1,3-glucano bajo condiciones de luz variables. J. Phycol. 54, 529–538 (2018).

Artículo Google Académico

Tilman, D., Hill, J. & Lehman, C. Biocombustibles de carbono negativo a partir de biomasa de pastizales de alta diversidad y bajos insumos. Ciencia (1979) 314, 1598–1600 (2006).

Google Académico

Kottuparambil , S. , Thankamony , RL & Agusti , S. La berenjena como fuente natural potencial de metabolitos de valor agregado . Una revisión. Res. de algas 37, 154–159 (2019).

Artículo Google Académico

Barsanti, L., Passarelli, V., Evangelista, V., Frassanito, AM & Gualtieri, P. Química, fisicoquímica y aplicaciones ligadas a actividades biológicas de los β-glucanos. Nat. Pinchar. Rep. 28, 457 (2011).

Artículo Google Académico

Spencer, D. & Morgan, H. Espectroscopía dieléctrica unicelular de alta velocidad. ACS Sens. 5, 423–430 (2020).

Artículo Google Académico

Salahi, A., Honrado, C., Rane, A., Caselli, F. & Swami, NS Glóbulos rojos modificados como estándares multimodales para comparar la citometría unicelular y la separación basada en la fisiología eléctrica. Anal. química 94, 2865–2872 (2022).

Koren, LE Medios de alto rendimiento para la fotosíntesis de Euglena gracilis ZJ Portozool 14, 17 (1967).

Google Académico

Cramer, M. & Myers, J. Crecimiento y características fotosintéticas de euglena gracilis. Arco. pelo. Mikrobiologie 17, 384–402 (1952).

Artículo Google Académico

Muramatsu, S. et al. Aislamiento y caracterización de un mutante defectuoso de motilidad de Euglena gracilis. PeerJ 8, e10002 (2020).

Artículo Google Académico

Cousins, RJ Un papel del zinc en la regulación de la expresión génica. proc. Nutrición Soc. 57, 307–311 (1998).

Artículo Google Académico

Kamalanathan, M., Chaisutyakorn, P., Gleadow, R. & Beardall, J. Una comparación del crecimiento fotoautotrófico, heterótrofo y mixotrófico para la producción de biomasa por el alga verde Scenedesmus sp. (clorofíceas). https://doi.org/10.2216/17-82.157, 309–317 (2019).

Descargar referencias

Este trabajo está respaldado por el programa JSPS Core-to-Core; Subvención JSPS para la Investigación Científica (No. 20K15151); Fundación Amada, Japón; Beca de Investigación Científica Sasakawa, Japón; Fundación NSG, Japón; Fundación White Rock, Japón; Proyecto Discovery del Consejo Australiano de Investigación (ARC) (DP200102269), Australia; y la Fundación de Apoyo al Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara, Japón; JST Support for Pioneering Research Iniciado por el programa Next Generation y el programa Touch stone del Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara.

División de Ciencia de Materiales, Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara, 8916-5 Takayama-cho, Ikoma, Nara, 630-0192, Japón

Tao Tang, Xun Liu, Tianlong Zhang, Ryota Kiya, Yoichiroh Hosokawa y Yaxiaer Yalikun

Centro de Investigación de Dinámica de Biosistemas (BDR), RIKEN, 1-3 Yamadaoka, Suita, Osaka, 565-0871, Japón

Yapeng Yuan, Yo Tanaka y Yaxiaer Yalikun

Escuela de Ingeniería, Universidad Macquarie, Sydney, 2109, NSW, Australia

Tianlong Zhang y Ming Li

Instituto de Ciencias e Ingeniería de Aguas Profundas, Academia de Ciencias de China, Sanya, Hainan, 572000, PR China

yang yang

Euglena Co. Ltd., Tokio, 108-0014, Japón

kengo suzuki

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Conceptualización: TT, YY; Metodología: TT, YY; Simulación: TT, XL; Experimentos: TT; Análisis de datos: TT, XL; Fabricación de dispositivos: TT, YY, YT, YY; Recurso: TT, RK, TZ, KS, YH e YY; Redacción del borrador original: TT; Revisión de escritura y edición: TT, YY, ML, YY, YT, YH; Adquisición de fondos: TT, YY, ML

Correspondencia a Yaxiaer Yalikun.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Tang, T., Liu, X., Yuan, Y. et al. Evaluación de la penetración eléctrica de las membranas celulares mediante citometría de impedancia de cuatro frecuencias. Microsyst Nanoeng 8, 68 (2022). https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

Descargar cita

Recibido: 09 febrero 2022

Revisado: 16 de mayo de 2022

Aceptado: 30 de mayo de 2022

Publicado: 24 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41378-022-00405-y

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt