Muestra de microfantasma de dispersión 3D para evaluar la precisión cuantitativa en técnicas de microscopía de fase tomográfica - El lago de los cisnes Co., Ltd de Shijiazhuang

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19586 (2022) Citar este artículo

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En este documento, presentamos una estructura de dispersión biomimética estructuralmente compleja, fabricada con polimerización de dos fotones, y utilizamos este objeto para comparar un sistema de imágenes computacionales. El fantasma permite adaptar la dispersión modificando sus grados de libertad, es decir, el contraste del índice de refracción y las dimensiones de la capa de dispersión, e incorpora una prueba de calidad de imagen 3D, que representa una sola célula dentro del tejido. Si bien la muestra se puede usar con múltiples técnicas de microscopía 3D, demostramos el impacto de la dispersión en tres métodos de reconstrucción de microscopía de fase tomográfica (TPM). Uno de estos métodos supone que la muestra tiene una dispersión débil, mientras que los otros dos tienen en cuenta la dispersión múltiple. El estudio se realiza en dos longitudes de onda (visible e infrarrojo cercano), que sirven como factor de escala para el fenómeno de dispersión. Encontramos que cambiar la longitud de onda de visible a infrarrojo cercano afecta la aplicabilidad de los métodos de reconstrucción TPM. Como resultado de la dispersión reducida en la región del infrarrojo cercano, las técnicas orientadas a la dispersión múltiple funcionan peor que un método destinado a muestras de dispersión débil. Esto implica la necesidad de seleccionar el enfoque adecuado según las características de dispersión de la muestra, incluso en el caso de cambios sutiles en la interacción objeto-luz.

Uno de los desafíos modernos en óptica computacional es obtener imágenes de muestras dispersas con alta resolución1. Esto se puede atribuir al hecho de que estructuras biológicas complejas, como esferoides u organoides, tienden a ser modelos más relevantes que los cultivos celulares 2D, por ejemplo, para el descubrimiento de fármacos2. Además, la mayoría de las técnicas de formación de imágenes in vivo requieren que la luz de sondeo atraviese la estructura compleja de un tejido, lo que limita en gran medida las profundidades de formación de imágenes debido a la dispersión múltiple. Esta demanda estimula el desarrollo de nuevos métodos1,3,4,5, sin embargo, es difícil seleccionar uno apropiado en función de la fuerza de dispersión de la muestra analizada. Por esta razón, un método versátil, repetible y cuantitativo para la evaluación de diferentes sistemas de imagen y algoritmos es esencial para determinar sus límites de aplicabilidad dependiendo de las propiedades de dispersión del objeto. Una posibilidad es utilizar microfantasmas calibrados como objetivos de formación de imágenes. Desafortunadamente, los microfantasmas existentes suelen ser de dispersión débil (p. ej., microesferas de índice coincidente) o demasiado simplistas (p. ej., microesferas de índice no coincidente)6,7 en comparación con los tipos de muestras multicelulares de dispersión heterogénea a las que están destinados los métodos de dispersión múltiple. Esta es una limitación crítica cuando se caracterizan los métodos de imágenes computacionales que utilizan solucionadores no convexos, donde la convergencia iterativa depende de la complejidad del panorama energético y se asocia directamente con la complejidad 3D de una muestra8.

En este trabajo presentamos un microfantasma impreso en 3D con distribución de índice de refracción (IR) de dispersión múltiple. Para hacerlo, aprovechamos los desarrollos recientes en la impresión 3D a través de la escritura láser directa9,10,11,12. Entre las múltiples técnicas de impresión 3D disponibles13,14,15,16,17,18, elegimos una polimerización de dos fotones que permite la impresión 3D de muestras microfantasma con geometría conocida y RI calibrado. Cuando se compara con otras implementaciones de escritura láser directa, permite (1) controlar el RI con un rango de modulación relativamente alto, (2) ajustar el contraste de RI o la fuerza de dispersión después de la fabricación usando diferentes líquidos de inmersión y (3) manejar y mida el microfantasma de la misma manera que las muestras biológicas. A continuación, presentamos la aplicación del fantasma en el campo de la microscopía de fase tomográfica (TPM), una técnica que ha demostrado impresionantes resultados de imágenes biológicas en trabajos anteriores. Sin embargo, es importante tener en cuenta que todos los métodos de imágenes computacionales pueden evaluarse con el procedimiento propuesto.

TPM es un método de imagen cuantitativo y sin etiquetas que utiliza proyecciones ópticas a través de una muestra semitransparente a lo largo de varios ángulos de iluminación para reconstruir la RI 3D de la muestra. Este método ha encontrado varias aplicaciones en imágenes biológicas, donde RI está directamente relacionado con la distribución de masa seca a nivel celular y subcelular. Se sabe que el índice de refracción y la masa seca son factores cruciales para analizar la etapa actual del ciclo celular19, la estructura celular20,21, los efectos fotobioquímicos en las células22, la influencia de factores externos en los parámetros celulares23,24 y muchos otros. Dada la gran cantidad de información proporcionada por la masa seca a nivel de una sola célula, existe una demanda importante para ampliar la capacidad de analizar la masa seca a grandes grupos multicelulares, cortes de tejido grueso o microorganismos completos. Sin embargo, para reconstruir RI 3D, los métodos TPM tradicionales utilizan suposiciones críticas en sus metodologías de reconstrucción computacional que se basan en que la muestra se dispersa débilmente25. Estas suposiciones limitan las muestras a tener espesores del orden de solo decenas de micras. Para muestras gruesas y complejas, se deben utilizar estructuras de reconstrucción que se adapten a la dispersión múltiple. Con este fin, se han propuesto numerosos enfoques TPM en los últimos años que introducen nuevos marcos para acomodar la dispersión múltiple26,27,28,29,30,31. En particular, estos enfoques utilizan solucionadores no lineales y no convexos para resolver iterativamente el RI 3D de una muestra. Aunque estos métodos han demostrado resultados impresionantes en la reconstrucción de RI en muestras de dispersión múltiple, su precisión cuantitativa aún no se ha caracterizado experimentalmente de manera sólida, y los resultados presentados generalmente no permiten la comparación de diferentes métodos para seleccionar el enfoque adecuado para un nivel de dispersión dado. en una muestra. La estrategia general para evaluar experimentalmente la precisión cuantitativa en los métodos TPM es reconstruir RI 3D en muestras con distribuciones de RI conocidas6,7,32. No se puede esperar que un método TPM de dispersión múltiple que genere reconstrucciones RI 3D precisas de un microfantasma de dispersión débil o demasiado simplista genere reconstrucciones RI igualmente precisas para muestras de dispersión múltiple más complejas, donde la probabilidad de converger a mínimos locales es drásticamente mayor. Para caracterizar sólidamente la precisión cuantitativa de los métodos TPM de dispersión múltiple, es imperativo utilizar microfantasmas con RI 3D conocida que imiten la complejidad estructural de los tipos de muestras que los métodos TPM intentan captar. Hasta donde sabemos, estos tipos de microfantasmas de dispersión múltiple estándar de oro no existen.

En esta sección presentamos el diseño del microfantasma impreso en 3D y su aplicación en la evaluación de tres métodos de reconstrucción TPM.

El microfantasma de dispersión que diseñamos e imprimimos en 3D consiste en un objetivo similar a una célula con estructuras de prueba internas33 incrustadas dentro de una distribución pseudoaleatoria de varillas que cambian su orientación en varias capas (Fig. 1a). El ancho y la altura de cada barra es igual a 0.5 \(\upmu\)m y 1.8 \(\upmu\)m respectivamente. La distancia lateral entre las varillas en cada capa se aleatoriza entre 0,7 \(\upmu\)ma 3 \(\upmu\)my las capas se apilan verticalmente cada 1,4 \(\upmu\)m. La estructura resultante es transparente (más del 99 % de transmitancia para el coeficiente de extinción de 0,1 mm\(^{-1}\)34) y dispersión múltiple35. La región de dispersión final es un cubo de 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\) 40 \(\upmu\)m con un factor de relleno de aproximadamente 25% (fracción de volumen ocupada por el polímero).

( a ) Vista de media sección del diseño de microfantasma de dispersión. ( b ) Imagen SEM de una capa de dispersión hecha de varillas distribuidas casi al azar. (c) Varilla individual que comprende una capa de dispersión. ( d ) Visualización de la distribución 3D RI del objetivo de imágenes: fantasma celular. Las características subcelulares, como los objetivos de resolución (que se muestran en el recuadro) y los nucléolos celulares, están encerrados en un elipsoide truncado con dimensiones externas de 30 \(\upmu\)m \(\times\) 25 \(\upmu\)m \ (\times\) 12 \(\upmu\)m, que luego se incrusta en el centro del 60 \(\upmu\)m \(\times\) 60 \(\upmu\)m \(\times\ ) Cubo de dispersión de 40 \(\upmu\)m.

El objetivo similar a una célula incrustado dentro de las capas de varillas distribuidas aleatoriamente imita una sola célula biológica encerrada dentro de un volumen de dispersión, que representa, por ejemplo, tejido. El objetivo de la célula se compone de subestructuras que permiten la evaluación de la precisión cuantitativa en los sistemas de imágenes TPM36. La información sobre el procedimiento de impresión 3D se proporciona en la Secc. "Fabricación de microfantasmas de dispersión 3D". Las características principales dentro del objetivo celular incluyen objetivos de prueba de resolución, nucléolos suspendidos en un núcleo y una región de variación lenta de RI (ver Fig. 1d). En particular, el objetivo de la prueba de resolución se compone de líneas con una frecuencia espacial creciente37 hasta 1667 lp/mm. Al evaluar la frecuencia espacial máxima de las líneas que se pueden distinguir dentro del objetivo de prueba celular, la resolución de imágenes de un método TPM de elección se puede caracterizar y comparar potencialmente con diferentes métodos de evaluación de resolución descritos por otros grupos de investigación38,39. La distribución pseudoaleatoria de bastones que componen la porción de dispersión de todo el microfantasma se suprime dentro de los 0,5 \(\upmu\)m del objetivo celular y no intersecan con ninguna de las estructuras de prueba. Un modelo del fantasma está disponible en Dataset 140.

Se implementaron y evaluaron tres métodos de reconstrucción TPM mediante la comparación de reconstrucciones tomográficas del microfantasma propuesto. Los métodos son: (1) Gerchberg-Paopulis con restricción de soporte (GPSC)41, (2) propagación de haz multicorte con mediciones de campo eléctrico (MSBP-E)42 y (3) propagación de haz multicorte con intensidad -solo mediciones (MSBP-I)31. Para realizar la comparación, el fantasma se midió con el dispositivo TPM y se compusieron dos conjuntos de datos a partir de las mediciones de campo disperso de valores complejos del microfantasma iluminado en diferentes ángulos, utilizando longitudes de onda de 633 nm y 835 nm. Para GPSC y MSBP-E, estos conjuntos de datos se usaron directamente. Para MSBP-I, solo se utilizaron los componentes de amplitud. Las mediciones y sus correspondientes reconstrucciones 3D RI están disponibles en Dataset 140.

La Figura 2 muestra los resultados de la reconstrucción para ambas longitudes de onda. Caracterizamos la resolución lateral (x e y) de las reconstrucciones TPM visualizando las líneas de prueba de resolución dentro del microfantasma. Para comparar cuantitativamente los tres métodos de reconstrucción TPM, se generaron gráficos transversales horizontales y verticales a través de estas pruebas de resolución calculando el promedio y la desviación estándar de los valores de píxel en filas o columnas adyacentes a las líneas blancas discontinuas aa y bb, por \(\pm 4\) píxeles. Estas parcelas transversales se muestran a continuación.

Comparación de reconstrucciones tomográficas del microfantasma medidas con longitudes de onda de 633 nm y 835 nm y calculadas con 3 algoritmos. Las regiones coloreadas sombreadas que rodean cada uno de los gráficos 1D en la parte inferior representan la desviación estándar.

La geometría compleja conocida y la distribución de RI del microfantasma desarrollado permiten demostrar que cambiar la longitud de onda de visible a infrarrojo cercano afecta la aplicabilidad de los métodos de reconstrucción TPM43,44. Las vistas ampliadas de la región de prueba de resolución después de reconstruir el microfantasma utilizando el algoritmo GPSC con luz de longitud de onda de 633 nm revela artefactos granulados significativos que ocluyen las características de la línea dentro de la región de prueba del microfantasma. Observamos que estos artefactos disminuyen considerablemente cuando se reconstruye con luz de longitud de onda de 835 nm. Esto sugiere que, a una longitud de onda de 633 nm, el microfantasma es demasiado disperso para que sea aplicable el GPSC. Los artefactos de reconstrucción de GPSC disminuidos para 835 nm coinciden con el conocimiento convencional de que las longitudes de onda de luz más largas son más resistentes a la dispersión que las longitudes de onda más cortas. Para confirmar que esta observación se debe a una dispersión reducida y no a características de ruido diferentes entre las dos fuentes de luz, analizamos la desviación estándar del ruido de fase en una región libre de objetos dentro de los conjuntos de datos de entrada. Para luz de longitud de onda de 633 nm, se observó una desviación estándar de ruido de fase de \(\sigma = 0,10\) radianes, mientras que para luz de longitud de onda de 835 nm, se observó una desviación estándar de ruido de fase de \(\sigma = 0,08\) radianes . Dada una variación tan pequeña entre estas características de ruido, concluimos que el factor principal en la calidad de reconstrucción del GPSC que afecta su capacidad para visualizar las líneas de prueba del microfantasma es la fuerza de dispersión del microfantasma en las dos longitudes de onda diferentes.

En particular, tanto MSBP-E como MSBP-I utilizan la regularización de variación total (TV) para estabilizar la convergencia del solucionador iterativo no convexo en presencia de ruido45. Especialmente en el caso de utilizar luz de longitud de onda de 633 nm, la regularización de TV da como resultado reconstrucciones RI 3D con menos ruido en comparación con las reconstrucciones 3D calculadas a través de GPSC, que no utiliza la regularización de TV. Esto se puede visualizar directamente en las secciones transversales 2D de la figura 2 y se confirma con los límites de la desviación estándar que se muestran en los gráficos de las secciones transversales 1D. Sin embargo, el inconveniente de la regularización es que tiene un efecto de desenfoque en las características de alta resolución. Debido a que el microfantasma se dispersa menos en luz de longitud de onda de 835 nm, solo GPSC logró reconstruir las líneas de prueba de alta frecuencia espacial dentro del microfantasma. Por lo general, la fuerza de la regularización de TV se ajusta manualmente para adaptarse a los factores experimentales y equilibrar el compromiso entre lograr una estabilidad iterativa frente a una alta resolución de imágenes.

En términos del RI promedio, el conocimiento sobre la distribución real del RI del fantasma hace posible comparar cuantitativamente los resultados de la reconstrucción con GPSC, MSBP-E y MSBP-I. Vemos que todos los métodos capturan con éxito las características a granel del microfantasma. Como se describió anteriormente, la reconstrucción 3D a través de GPSC exhibe artefactos granulados cuando se usa luz de longitud de onda de 633 nm, probablemente debido a que el microfantasma es de dispersión múltiple en esa longitud de onda. Además, MSBP-I produce valores de RI ligeramente sobreestimados y también sufre de artefactos espaciales de baja frecuencia (que se han observado en otras técnicas de imagen de fase de intensidad única46,47). Otros trabajos han demostrado que MSBP-I demuestra una mayor precisión cuando se utiliza iluminación parcialmente coherente, lo que reduce drásticamente el ruido coherente31. El trabajo futuro puede incluir repetir este análisis en una gama más amplia de técnicas de reconstrucción de TPM con microfantasmas de dispersión más complejos.

Con los resultados presentados, mostramos que cambiar la longitud de onda de la iluminación afecta la naturaleza de dispersión del microfantasma. Específicamente, aunque el microfantasma es de dispersión múltiple con luz de longitud de onda de 633 nm, es de dispersión débil con luz de longitud de onda de 835 nm. Esto indica naturalmente que la elección óptima para la longitud de onda de iluminación debe equilibrarse entre la resolución (\(\frac{\lambda }{NA}\) para una sola proyección) y la fuerza de dispersión. Como se ha mostrado, hay casos en los que en lugar de aplicar métodos de dispersión múltiple, es ventajoso aumentar la longitud de onda de la iluminación (disminuyendo así la fuerza de dispersión de la muestra) y aplicar un método basado en el Teorema de Difracción de Fourier que no utiliza el restricción de variación total. Sin embargo, de manera más fundamental, demostramos que los microfantasmas impresos en 3D permiten una evaluación cuantitativa de la precisión de la reconstrucción de RI en 3D en varias metodologías de TPM. Esta capacidad es importante al elegir un método TPM optimizado para clases específicas de muestras y condiciones de imagen.

Los trabajos futuros se centrarán en desarrollar métodos para cuantificar la fuerza de dispersión de los fantasmas y relacionar estas cantidades con las propiedades de dispersión de diferentes tipos de tejido. Si tiene éxito, esto nos permitiría diseñar y fabricar (utilizando los métodos presentados) estructuras de microfantasmas en 3D para imitar una amplia gama de especímenes biológicos que van desde grupos multicelulares hasta tejidos a granel y pequeños organismos. Otra dirección posible es ajustar los parámetros de dispersión en el fantasma para caracterizar el rendimiento de las imágenes para diversas técnicas utilizadas para obtener imágenes en el tejido de dispersión, como la tomografía de coherencia óptica o la microscopía de reflectancia confocal. Finalmente, imaginamos que uno puede explotar la flexibilidad de la polimerización de dos fotones para fabricar microfantasmas en diferentes sustratos (por ejemplo, en el extremo de la fibra óptica para la tomografía de rotación de muestras), utilizando resinas biocompatibles (para combinar objetivos de prueba con las células vivas). en el volumen de medición único48) o modificar la resina con partículas funcionales18 (por ejemplo, para adaptarse a sistemas que también miden la absorción49,50,51,52,53).

Presentamos a continuación la (1) metodología con la que imprimimos microfantasmas de dispersión múltiple en 3D; (2) el diseño óptico de los sistemas de imágenes TPM que usamos para recolectar experimentalmente mediciones de campo eléctrico de dispersión del microfantasma; y (3) breves descripciones teóricas de tres algoritmos tomográficos que se utilizaron para reconstruir 3D RI a partir de los datos medidos.

El fantasma se fabrica utilizando litografía láser de dos fotones, en la que un rayo láser enfocado se escanea dentro de resina líquida. La resina dentro del volumen focal del láser se polimeriza localmente. El ajuste de la trayectoria de escaneo y el tiempo de exposición del rayo láser permite el control simultáneo de la geometría impresa en 3D (precisión del orden de 100 nm) y RI (precisión del orden de \(5 \times 10^{-4}\) , máximo \(\Delta\)RI = 0.03 dentro de la estructura) en tres dimensiones. Utilizamos Photonic Professional GT (Nanoscribe GmbH) equipado con un objetivo de microscopio 1.3 NA 100\(\times\) y una etapa de exploración piezoeléctrica. El fantasma se fabrica en la resina IP-Dip (Nanoscribe GmbH) sobre un cubreobjetos #1.5H (configuración de inmersión54). Después de la fabricación, la estructura se reveló en PGMEA (acetato de éter monometílico de propilenglicol; 12 min), seguido de alcohol isopropílico (10 min) y luego se secó con secador. La metodología completa para la fabricación y validación de las funciones se puede encontrar en nuestro trabajo anterior33.

Para realizar nuestros experimentos de imágenes de TPM, el microfantasma se sumergió en aceite Zeiss Immersol 518F (RI\(_{632}\) nm = 1,5123), que proporciona un contraste RI similar al del caso de las células sumergidas en medio de cultivo. Mediante el uso de aceites de inmersión con RI variable, es posible ajustar las propiedades de dispersión de la post-fabricación microfantasma.

En este trabajo se utilizó un sistema óptico, como se muestra en la Fig. 3a), para estudiar el espectro de dispersión. El sistema es un microscopio TPM55 basado en Mach-Zehnder, que funciona en una configuración de ángulo limitado con muestra estacionaria e iluminación girada con un espejo galvo (Thorlabs GVS212/M)56. La investigación se realizó con dos longitudes de onda y, por lo tanto, hubo dos versiones modificadas del microscopio tomográfico presentado. La primera versión, \(\text {TPM}_{633}\) funciona con longitud de onda \(\lambda =\) 633 nm y la segunda, \(\text {TPM}_{835}\) con \(\lambda =\) 835nm. El haz de entrada (S en la Fig. 3a) se entrega con una fibra óptica, se colima y luego se divide en objeto y brazo de referencia. En el sistema \(\text {TPM}_{633}\) la fuente de luz era un láser de rejilla de Bragg de volumen (Necsel NovaTru Chroma 633 SLM), \(\text {S}_{633}\), que proporcionaba un solo modo longitudinal y ofrece una longitud de coherencia larga. El sistema \(\text {TPM}_{835}\) utilizó una fuente de barrido (Superlum Broadsweeper BS-840-2-HP, \(\Delta \lambda\)= 800–870 nm), \(\text { S}_{835}\) establecido en \(\lambda =\) 835 nm. Debido a la diferencia en la longitud de coherencia, se colocó un módulo de retardo adicional en el haz de referencia para las mediciones de \(\text {TPM}_{835}\). Los cubos de división de haz en este trabajo se recubrieron de 400 a 700 nm o de 700 a 1100 nm, según la longitud de onda utilizada. La distancia focal de la lente del tubo TL1 era \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 150 mm y \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 200 mm respectivamente. Ambos objetivos del microscopio (MO1 y MO2) en la Fig. 3 eran objetivos 100\(\times\) NA 1.3 Semiplan-apocromáticos, corregidos al infinito. La segunda lente de tubo que usó TL2 fue \(\text {EFL}_{633}\text {=}\) 200 mm o \(\text {EFL}_{835}\text {=}\) 300 mm. Esto proporcionó aumentos \(M_{633}=-\,48.5\) y \(M_{835}=-\,72.7\). La cámara utilizada en el sistema fue un sensor CMOS en ambos casos, con un tamaño de píxel de 3,45 \(\mu m\) (JAI BM500GE) en el caso de \(\text {CAM}_{633}\) y 5,5\(\ mu m\) tamaño de píxel (Basler acA2040-180km) en el caso de \(\text {CAM}_{835}\). El aumento mínimo, que se impone por el tamaño de píxel y la longitud de onda para asegurar la grabación correcta del holograma para cada proyección57 es \(M_{633 min}=-\,44,2\) y \(M_{835 min}=-\,53,5 \), que se cumple en ambos casos. Un holograma de muestra se presenta en la Fig. 3b). Ambos sistemas se configuraron para iluminar la muestra con un escenario de exploración circular (ver Fig. 3d) en un ángulo cenital \(\theta =47^{\circ }\) y proporcionaron 180 proyecciones espaciadas en \(\varphi =2^{\ círculo }\). Una muestra de la fase y amplitud proporcionada por el sistema a 835nm se presenta en la Fig. 3c y e.

(a) Sistema de medición TPM basado en Mach-Zehnder. S, fuente de luz; GM, sistema galvo; TL1 y TL2, lentes de tubo; MO1 y MO2; objetivo de microscopio; SPL, plano de muestra; LEVA, cámara; (b) holograma adquirido con iluminación axial de la muestra; (c) amplitud de una proyección en \(\varphi =304^{\circ }\); d) Escenario de barrido circular utilizado en la medición. Ángulo de rotación: \(\varphi\), ángulo cenital: \(\theta =47^{\circ }\); e) Fase de la proyección.

Había tres métodos de reconstrucción de TPM diferentes para calcular el RI 3D del microfantasma utilizado para la comparación. Los datos para cada método se adquirieron a través de las mediciones de dispersión multiángulo capturadas como se describe en la Secc. "Sistema de medida". Proporcionamos una breve descripción de estos métodos a continuación. Las descripciones completas de estos métodos se dan en las referencias respectivas.

Para proporcionar un estándar de referencia para comparar con los algoritmos de reconstrucción TPM que utilizan modelos de dispersión múltiple, primero reconstruimos el RI 3D del microfantasma utilizando un método TPM de dispersión débil. Usamos específicamente el algoritmo de Gerchberg-Papoulis mejorado con una restricción adicional de soporte de objetos finitos (GPSC)41. Los campos eléctricos de valores complejos medidos por nuestros sistemas TPM se utilizan como entradas. El procedimiento se realiza en dos pasos. En primer lugar, se reconstruye una distribución tomográfica 3D RI inicial a partir de las mediciones del campo eléctrico con una fuerte regularización de variación total45. Esto se realiza a través del método de optimización Chambolle-Pock58 y se implementa con la caja de herramientas de tomografía ASTRA59. El resultado se binariza y se genera un soporte de objetos finitos. En segundo lugar, se utiliza un algoritmo clásico de Gerchberg-Papoulis que es una versión iterativa del método de Inversión Directa (también conocido como transformada de Wolf)60. Este procedimiento iterativo se basa en el teorema de difracción de Fourier61 y utiliza una aproximación de dispersión de primer orden. Aquí, la reconstrucción y su transformada de Fourier se calculan alternativamente y se aplican restricciones: no negatividad y soporte de objetos finitos en el dominio de la señal, y reposición de las proyecciones originales en el dominio de la frecuencia.

Nuestro método principal para modelar la dispersión múltiple es el método de propagación de haz multicorte (MSBP)62, que recientemente ha mostrado resultados prometedores para la obtención de imágenes biológicas42,63. En nuestra primera implementación de MSBP, usamos exactamente el mismo conjunto de datos de campo eléctrico utilizado por GPSC desde arriba. Se selecciona una estimación inicial del RI 3D de la muestra para iniciar el procedimiento iterativo. Posteriormente, el método MSBP se usa para simular mediciones de dispersión resultantes de ondas planas que se propagan a través del RI 3D estimado inicial de la muestra. Los campos dispersos resultantes de esta simulación se comparan con los obtenidos experimentalmente con nuestros sistemas TPM. El error calculado entre las mediciones simuladas y experimentales se propaga hacia atrás a través de cada capa de la estimación de muestra 3D para modificar de forma incremental el valor de RI de cada vóxel. Las iteraciones continuas que repiten estos pasos finalmente dan como resultado que la estimación de la muestra 3D converja en una solución estable de estado estacionario. Implementamos el MSBP con mediciones de campo eléctrico (MSBP-E) a través del algoritmo de tomografía de aprendizaje (LT)42. El procedimiento LT es un algoritmo de optimización iterativo con regularización de variación total (TV) débil adicional aplicada en cada iteración para garantizar la convergencia. Descubrimos que el método funciona mejor cuando se elige una conjetura inicial como punto de partida para el proceso iterativo. En este artículo, usamos el método de inversión directa para proporcionar la suposición inicial.

Trabajos recientes han demostrado que el paso de actualización de gradiente dentro del método MSBP se puede reformular para reconstruir RI 3D solo a partir de mediciones de intensidad no interferométricas31. Las principales ventajas de este método incluyen el uso de un sistema de imágenes no interferométrico, que es resistente a las inestabilidades mecánicas que a menudo limitan el uso a largo plazo de los interferómetros de doble brazo sin realineación. Además, la fuente de luz puede ser parcialmente coherente, para evitar artefactos de motas coherentes en las mediciones, al tiempo que conserva la coherencia suficiente necesaria para la reconstrucción de RI. Con el propósito de demostrar la reconstrucción 3D RI utilizando esta variante de MSBP de solo intensidad (a la que nos referimos aquí como MSBP-I), simplemente usamos el componente de amplitud de las mediciones de campo eléctrico utilizadas para las reconstrucciones GPSC y MSBP-E, descrito arriba. De manera similar a MSBP-E, la regularización de variación total se aplica en cada iteración. El punto de partida de MSBP-I es una matriz de ceros.

Todos los métodos de reconstrucción TPM descritos son procedimientos iterativos que usan el mismo criterio de parada para terminar automáticamente los cálculos. Este criterio es una modificación de un método presentado anteriormente64, y se describe en Alg. 1 a continuación. La intuición general detrás de este procedimiento es terminar el proceso de cálculo iterativo cuando la dinámica del cambio entre las estimaciones de muestra 3D generadas a partir de iteraciones consecutivas cae por debajo de cierto nivel de saturación \(\epsilon\). Para depender menos de los valores atípicos, se calcula el valor medio de la dinámica de las últimas 10 iteraciones. El valor de \(\epsilon\) se elige empíricamente para cada algoritmo. Para GPSC \(\epsilon =0.02\), para LT y MS \(\epsilon =0.01\). Los valores de \(\epsilon\) se eligieron empíricamente para equilibrar la convergencia incompleta y la velocidad de reconstrucción.

Los datos subyacentes a los resultados presentados en este documento están disponibles en el conjunto de datos 140.

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Descargar referencias

Los autores quieren agradecer al prof. Maciej Szkulmowski de la Universidad Nicolaus Copernicus por proporcionar acceso a la fuente de luz infrarroja cercana utilizada en este trabajo. Los autores quieren agradecer a Demetri Psaltis y Joowon Lim de École Polytechnique Fédérale de Lausanne por proporcionar el código para el algoritmo de tomografía de aprendizaje.

La investigación que condujo a los resultados descritos se llevó a cabo dentro del programa TEAM TECH/2016-1/4 de la Fundación para la Ciencia Polaca, cofinanciado por la Unión Europea bajo el Fondo Europeo de Desarrollo Regional. El desarrollo del objeto de calibración fue financiado por el proyecto FOTECH-1 otorgado por la Universidad Tecnológica de Varsovia bajo el programa Excellence Initiative: Research University (ID-UB). También agradecemos el apoyo de la Universidad de Texas en Austin, la Escuela de Ingeniería Cockrell y la Iniciativa Chan Zuckerberg.

Instituto de Micromecánica y Fotónica, Universidad Tecnológica de Varsovia, calle Boboli 8, Varsovia, 02-525, Polonia

Wojciech Krauze, Arkadiusz Kuś, Michał Ziemcznok y Małgorzata Kujawińska

Departamento de Ingeniería Eléctrica, Universidad de Texas en Austin, 2501 Speedway, Austin, TX, 78712, EE. UU.

Max Haimowitz y Shwetadwip Chowdhury

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Crédito. WK: conceptualización, análisis formal, metodología, software, visualización, redacción–borrador original. AK: conceptualización, adquisición de fondos, investigación, metodología, administración de proyectos, visualización, redacción–borrador original. MZ: curación de datos, investigación, metodología, recursos, visualización, redacción–borrador original. MH: software, redacción, revisión y edición. SC: adquisición de fondos, software, redacción, revisión y edición. MK: adquisición de fondos, administración de proyectos, redacción, revisión y edición.

La correspondencia es Wojciech Krauze.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Krauze, W., Kuś, A., Ziemczonok, M. et al. Muestra de microfantasma de dispersión 3D para evaluar la precisión cuantitativa en técnicas de microscopía de fase tomográfica. Informe científico 12, 19586 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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Recibido: 31 agosto 2022

Aceptado: 11 noviembre 2022

Publicado: 15 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24193-7

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