Modo novedoso de cierre defectuoso del tubo neural en el no - El lago de los cisnes Co., Ltd de Shijiazhuang

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 16917 (2015) Citar este artículo

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Si no se cierra el tubo neural, se producen defectos de nacimiento, con una gravedad que va desde la espina bífida hasta la anencefalia letal. Se conocen pocos factores de riesgo genéticos para defectos del tubo neural en humanos, lo que destaca el papel fundamental de los factores de riesgo ambientales, como la diabetes materna. Sin embargo, no se comprende bien cómo el metabolismo materno alterado interfiere con el desarrollo embrionario y con la neurulación en particular. Presentamos evidencia de dos modelos de ratón independientes de embarazo diabético que identifica la migración alterada de células mesodérmicas nacientes en la racha primitiva como la base morfogenética que subyace a la patogénesis de los defectos del tubo neural. Concluimos que la gastrulación perturbada no solo explica los defectos de neurulación, sino que también proporciona una etiología unificadora para el amplio espectro de malformaciones congénitas en embarazos diabéticos.

Si no se cierra el tubo neural, se producen anomalías congénitas1,2, con una gravedad que va desde la espina bífida oculta asintomática y los casos de espina bífida corregibles quirúrgicamente hasta condiciones letales como la exencefalia y la anencefalia. Se han identificado aproximadamente 400 genes en el ratón donde las mutaciones causan o contribuyen a defectos de neurulación3,4. Por el contrario, se conocen comparativamente pocos factores de riesgo genéticos en humanos5, lo que destaca el papel fundamental de los factores de riesgo ambientales, como la deficiencia de ácido fólico6 o la diabetes materna7,8,9,10. Sin embargo, a pesar de un mejor suministro de ácido fólico en la dieta y un mejor control de la glucemia, la incidencia de defectos del tubo neural (DTN) se ha reducido solo parcialmente11,12. El riesgo existente de defectos del tubo neural exige una mejor comprensión de cómo los factores ambientales interfieren con el desarrollo embrionario en general y con la neurulación en particular.

La cepa de ratones diabéticos no obesos (NOD), que es propensa a desarrollar diabetes autoinmune espontáneamente, es un modelo establecido para la diabetes tipo I humana13,14. Los embriones de embarazos diabéticos NOD están afectados por una tasa muy alta de defectos del tubo neural15 (DTN) y defectos cardíacos16,17, otro sello distintivo de la teratogenicidad de la diabetes. Aquí informamos que la suplementación periconcepcional con ácido folínico en madres diabéticas NOD redujo la incidencia de defectos del tubo neural del 40,2 % al 21 % (p = 0,006, Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, en paralelo a los embarazos humanos, los defectos del tubo neural en este modelo responden parcialmente al folato.

Inesperadamente, encontramos que en embriones de madres NOD hiperglucémicas, la placa neural mostraba tejido ectópico sobresaliente en varios lugares a lo largo del eje anterior-posterior (Fig. 1a-f). Las protuberancias se limitaron estrictamente a los embarazos diabéticos y ocurrieron en el 25,3 % de los embriones a los 8,5 días de gestación (E8,5). Para probar si las protuberancias eran exclusivas de la cepa NOD, indujimos hiperglucemia en hembras de la cepa FVB con estreptozotocina18, lo que resultó en una incidencia de defectos del tubo neural del 21,6 %19. En E8.5, el 12,9% de los embriones FVB expuestos a hiperglucemia mostraron protuberancias (Fig. 1g, h). La apariencia general, la ubicación a lo largo del eje anterior-posterior y la organización interna (Fig. 1k) de las protuberancias fueron sorprendentemente similares al fenotipo de los embriones NOD expuestos. Por lo tanto, estas malformaciones no son una peculiaridad de los antecedentes genéticos de la cepa NOD, sino que surgen de la hiperglucemia materna grave (Tabla complementaria 1) común a ambos modelos experimentales.

Fenotipo de protrusión de la placa neural en embriones de embarazos diabéticos.

(a) a (d), Embriones de embarazos diabéticos de la cepa NOD con protuberancias (triángulos), generalmente en localizaciones caudales. (e), embrión NOD con una protuberancia a nivel del rombencéfalo, rostral al frente de cierre del tubo neural; Vista lateral; inserto: vista de la superficie dorsal del embrión. (f), embrión NOD con dos protuberancias: una pequeña en la región media/del cerebro anterior y una más grande en el área del tronco. Insertar: secciones virtuales a través de las áreas de la placa neural no afectadas (arriba) y afectadas (abajo). En comparación con la región no afectada, el área afectada por una protuberancia muestra una organización normal general con la excepción de una protuberancia en la línea media. Este bulto tiene una capa externa similar y contigua al neuroepitelio y un núcleo donde los núcleos celulares son escasos. ( g, h ), los embriones de embarazos diabéticos de la cepa FVB muestran protuberancias similares a las observadas en la cepa NOD. El embrión en el panel g tiene dos malformaciones de este tipo: una pequeña en el extremo caudal del rombencéfalo prospectivo y una más grande en la región caudal del tronco. (i–k), imágenes derivadas de la reconstrucción tridimensional de datos de imágenes confocales de embriones completos teñidos con DAPI. (i), el mismo embrión que en el panel e, que se muestra con una superficie (púrpura) calculada a partir de datos de volumen. La protuberancia a nivel del rombencéfalo es claramente perceptible. (j), Dos aspectos de un plano de sección parasagital virtual en presentación de 'libro abierto'. La protuberancia es contigua al neuroepitelio, y el núcleo muestra una menor densidad de núcleos celulares teñidos con DAPI, que recuerdan al carácter mesenquimatoso. (k), presentación de 'libro abierto' del embrión FVB que se muestra en el panel h. La apariencia morfológica de las protuberancias es similar en los embriones NOD y FVB expuestos a diabetes.

Las imágenes por microscopía confocal de 2 fotones, la reconstrucción tridimensional de embriones completos a partir de secciones ópticas (Fig. 1i) y la generación posterior de vistas de un solo plano permitieron un examen más detallado de la unión entre una protuberancia y el embrión (Fig. 1j, k ). Detectamos contigüidad entre la protuberancia y la placa neural, con la capa exterior parecida al neuroepitelio. El núcleo de una protuberancia mostró una densidad celular más baja, que recuerda al carácter mesenquimatoso. Esto sugirió que las protuberancias no están compuestas exclusivamente por células neuroepiteliales.

Para determinar el origen de las protuberancias, realizamos perfiles de expresión génica en tejido de protuberancias microdiseccionado del modelo FVB, utilizando secuenciación de etiquetas de expresión 3'. A modo de comparación, realizamos una microdisección con láser del tubo neural abierto inmediatamente anterior al sitio de cierre 1 (Fig. 2a-c complementaria). El análisis de la expresión del gen Noto indicó que las muestras del tubo neural estaban libres de notocorda potencialmente contaminante (Fig. 2d-h complementaria). Identificamos 799 genes con expresión diferencial estadísticamente significativa en protuberancias en comparación con el tubo neural abierto (Fig. 2a, Figura complementaria 2j) y confirmamos las observaciones basadas en secuenciación mediante RT-PCR cuantitativa para genes seleccionados (Fig. 2b). El agrupamiento jerárquico demostró una clara distinción de los perfiles de expresión entre las protuberancias y el tubo neural abierto (Fig. 2i complementaria). Las anotaciones para los 570 genes con expresión predominante en las protuberancias se enriquecieron significativamente para los términos GO "formación de mesodermo" y "desarrollo de mesodermo".

Análisis molecular de las protuberancias de la placa neural.

(a) El perfil del transcriptoma se realizó mediante secuenciación de etiquetas de expresión 3' (SAGE) en un secuenciador de próxima generación AB SOLiD 5500XL. Las comparaciones entre 3 protuberancias individuales (n = 3) y el neuroepitelio del tubo neural abierto de 4 embriones (n = 4) se realizaron utilizando DESeq. Los datos se muestran como una gráfica de volcán, con significancia estadística expresada como –log10(padj) graficada frente a la relación de expresión (protuberancia frente a tubo neural). El color gris representa genes que no alcanzaron significación estadística (corrección de Benjamin-Hochberg); genes de etiquetas rojas con prevalencia de expresión en las protuberancias; entre estos genes, el color azul indica genes con un papel conocido en el desarrollo del mesodermo. El verde indica genes con predominio en el tubo neural abierto, y el color naranja indica dos genes de interés. Los genes en los que la expresión estaba completamente ausente en un lado del paradigma se trazaron en un log2 de 10 o -10. ( b ) Validación de la diferencia de expresión de genes seleccionados mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se eligieron para validación ocho genes con predominio en protrusiones (Acvr1b, Dll3, Mixl1, Nodal, Noto, T, Tbx6 y Wnt3a) y dos genes (Fgfr2, Zic1) con expresión predominante en tubo neural abierto. Se analizaron las mismas muestras de las que se derivaron los datos de secuenciación; por lo tanto, medimos los niveles de expresión génica en cuatro réplicas técnicas de cada una de las tres protuberancias y en cuatro réplicas técnicas de cada una de las 4 muestras de neuroepitelio (de 4 embriones individuales). Las barras representan la relación de expresión entre las protuberancias y el tubo neural expresada como log2. La significación estadística en una prueba t se indica mediante un símbolo de estrella. Las proporciones de expresión obtenidas del experimento de secuenciación se confirmaron para todos los genes candidatos, excepto para Nodal, que mostró la dirección esperada para la diferencia de expresión, pero no alcanzó significación estadística.

Para 85 de estos genes, los patrones de expresión en las etapas de Theiler 11 a 13 (que corresponden a los días de gestación E7.5 y E8.5) se informaron previamente (MGI, http://www.informatics.jax.org/): 22 Se sabe que los genes se expresan en el neuroectodermo y el mesodermo, 33 se limitan al mesodermo, 10 se expresan en el nódulo y 28 genes en la línea primitiva (Tabla complementaria 4). Estos resultados demuestran que las protuberancias contienen mesodermo y vinculan las protuberancias con redes moleculares que están activas durante la gastrulación: las protuberancias presentaban expresión de genes que se sabe que están involucrados en la gastrulación temprana, como Nodal y Furin, que se requiere para la activación de Nodal20 y de componentes involucrados en mantenimiento de la racha primitiva21, como Fgf8, Wnt3a y T/brachyury. También detectamos objetivos de T, por ejemplo, Cdx2, Axin2 y Lef1, junto con 57 genes en las redes reguladoras impulsadas por T 22,23, así como 153 objetivos aguas abajo de Cdx222 (Tabla complementaria 5); estos incluían marcadores de mesodermo axial, paraxial y lateral conocidos. La presencia de estas redes reguladoras indica que las células mesenquimatosas en las protuberancias se han sometido a todo el programa de especificación del mesodermo actualmente conocido.

Los análisis de embriones NOD por hibridación in situ en E8.5 (Fig. 3) revelaron paralelismos entre las protuberancias que surgen de la hiperglucemia materna de inicio espontáneo e inducida químicamente, respectivamente. Sox2, un marcador del epiblasto/linaje neuronal24, estaba presente en toda la capa exterior de la protuberancia, mientras que T, un marcador de la racha primitiva y el mesodermo naciente25, se extendía hacia el núcleo proximal de la protuberancia. Tbx6, un marcador de mesodermo comprometido24,26, se encontró en la línea primitiva y en las células migratorias de las alas mesodérmicas. La expresión de Tbx6 en el núcleo de una protuberancia recordaba el desarrollo adecuado del mesodermo27: la expresión era más fuerte donde la expresión de T ya se había extinguido. En general, estos datos indican que la migración de las células mesodérmicas no está completamente bloqueada, sino que se ve afectada localmente alrededor de la protuberancia.

Análisis histológicos de las protuberancias de la placa neural.

(a) Esquema de un embrión de ratón en la etapa 11 de Theiler (http://www.emouseatlas.org/). Las líneas negras indican el plano de corte de las secciones que se muestran en los paneles (c–e). Colores: morado – ectodermo y mesodermo embrionario; verde azulado - amnios y alantoides; azul: endodermo y saco vitelino; amarillo - deciduo. (b) Representación de un embrión de ratón con una protuberancia (rojo); las líneas negras indican series de planos de corte para secciones mostradas en paneles (pies) en secuencia rostral a caudal, a través de la protuberancia. (c) Sección a través de la región posterior de un embrión de un embarazo NOD normoglucémico en el estadio 11 de Theiler después de la hibridación in situ con una sonda para Sox2. La señal de Sox2 está restringida a la capa epiblasto/ectodérmica. La línea punteada representa el límite del embrión. ( d ) Sección adyacente teñida con una sonda para T, que revela la expresión de T en la línea primitiva y el mesodermo naciente migratorio. (e) Sección adyacente desarrollada con una sonda para Tbx6, que muestra la expresión de Tbx6 en la capa mesendodérmica en la línea primitiva y las alas mesodérmicas. (ft) Serie de secciones adyacentes a través de un embrión de un embarazo NOD diabético en la etapa 11 de Theiler que presenta una protuberancia. El panel (f) muestra el aspecto rostral inicial de la protuberancia, mientras que el panel (t) muestra la sección más caudal de la secuencia. (f, i, l, o, r), secciones analizadas para la expresión de Sox2, que se detecta en la capa exterior de la protuberancia. (g, j, m, p, s), secciones adyacentes del mismo embrión que revelan la expresión de T. En la cara rostral, se detecta T en la base de la protuberancia en una región que recuerda a la línea primitiva. En el centro de la protuberancia (panel (m)), T se expresa tanto en la capa exterior como en el núcleo. (h, k, n, q, t). Las secciones adyacentes sondearon la expresión de Tbx6. Tbx6 se detecta de manera prominente en el núcleo de la protuberancia y está ausente de la capa exterior. La presencia de Tbx6 en las alas mesodérmicas representa la expresión normal de este gen en dominios donde la expresión de T ya ha cesado.

El mesodermo ectópico en las protuberancias podría deberse a una proliferación alterada de células mesodérmicas recién generadas o a una migración desorientada del mesodermo naciente. Los análisis histológicos respaldan la segunda posibilidad: no encontramos evidencia de una mayor proliferación celular, ya que la tinción para el marcador de mitosis Phospho-Histone 3 no reveló un enriquecimiento en las protuberancias en comparación con el resto del embrión. En cambio, detectamos la deposición de laminina entre las células mesodérmicas dentro y en la base de una protuberancia (Fig. 4). Esto es paralelo a la expresión predominante de protrusión de Laminin α5, Nidogen 2 (componentes de la lámina basal28,29) e Integrin α6, un receptor para Lama530 y es consistente con un informe anterior de expresión elevada de componentes de matriz extracelular en embriones de rata expuestos a condiciones de hiperglucemia31. Estos datos implican una adhesión celular alterada o una migración deteriorada de las células mesodérmicas en la formación de protuberancias.

Las protuberancias presentan depósito interno de laminina.

Embriones en tres etapas diferentes de desarrollo, con protuberancias: E8.0, etapa de pliegue craneal (a–d) E8.5 con placa neural abierta en la región caudal (e–h) y E9.5 con una gran protuberancia que interfiere con el tubo neural cierre (i–l). Las secciones se tiñeron para ADN ((a,e,i); azul, Hoechst 33342), histona 3 fosforilada ((b,f,j); PH3, verde) y laminina ((c,g,k); rojo); las imágenes en color combinadas se muestran en (d,h,l) respectivamente. Abreviaturas: ac, cavidad amniótica; da, aorta dorsal; en, endodermo; ep, capa de epiblasto; hf, vendaje; hg, intestino posterior; mw, ala mesodérmica; np, placa neural; p, protrusión; entonces, somatopleura; spl, esplacnopleura. Todas las protuberancias, desde la etapa temprana hasta la etapa madura, presentan acumulaciones internas de laminina en el mesénquima (triángulos amarillos). Además, la capa celular externa está típicamente separada del mesénquima interno por una capa de matriz extracelular positiva para laminina.

La evidencia de migración deteriorada provino de cultivos de explantes (Fig. 5) en condiciones que respaldan la migración y la diferenciación del mesodermo, confirmada en virtud de la tinción para Vimentin32 (Fig. 5b, c). En estos cultivos, el crecimiento de explantes de tejido posterior de embriones NOD expuestos a diabetes en E7.5 o en E8.5 se redujo significativamente en comparación con la migración de explantes de embriones de embarazos NOD normoglucémicos (Fig. 6a). Además, para los embriones expuestos a la diabetes, comparamos cultivos de protuberancias diseccionadas con explantes del tejido posterior adyacente en E8.5. Las células de las protuberancias no lograron migrar lejos del explante o migraron significativamente menos en comparación con el crecimiento observado en el explante de tejido posterior correspondiente (comparar dentro de los marcos verdes: Fig. 5g,h,i a j,k,l y Fig. 5m ,n,o a p,q,r, respectivamente y Fig. 6b). La migración reducida de células lejos de las protuberancias no se puede atribuir a la inmadurez del desarrollo, ya que las células de embriones anteriores exhiben una capacidad migratoria comparable en estos ensayos (Figura 3a complementaria); la extensión del crecimiento tampoco se correlacionó con el tamaño del explante inicial (Figura complementaria 3b). Por lo tanto, concluimos que la exposición a la diabetes materna es responsable de la alteración de la capacidad migratoria del mesodermo en las protuberancias. Finalmente, el crecimiento de los explantes de embriones NOD E8.5 expuestos a diabetes se redujo en comparación con los explantes de embriones E8.5 expuestos a diabetes de la cepa FVB (Fig. 6c), lo que podría explicar la mayor incidencia de protuberancias en el modelo NOD. en comparación con FVB.

Cultivos de explantes de protuberancias y tejido embrionario posterior.

Imágenes de cultivos de explantes. Los explantes fijados se tiñeron con un anticuerpo contra vimentina (verde), faloidina (rojo) para detectar actina y DRAQ5 (azul) para localizar núcleos celulares. Las condiciones de cultivo respaldaron la migración y la diferenciación del mesodermo, incluido el mesodermo cardíaco, como lo demuestra la formación de centros rítmicamente contráctiles en explantes de rachas primitivas de embriones E7.5 de embarazos NOD normales (video de lapso de tiempo en Información complementaria). Los recuadros identifican el área representada en las imágenes de primer plano. (a) El explante de un embrión E7.5 NOD normal tenía un área de miocitos que se contraían rítmicamente (círculo naranja). (b) El mismo explante después de la tinción, en contraste de campo oscuro. (c) Ampliación de primer plano del área insertada. ( d - f ) Explante de un embrión E8.5 NOD expuesto a diabetes. (g–l,m–r) Los explantes correspondientes de tejido posterior y la protuberancia del mismo embrión se agrupan en un marco verde. En comparación con el tejido posterior del mismo embrión, respectivamente, (g–i,m–o) las protuberancias muestran muy poco crecimiento (j–l,p–r).

La exposición a la diabetes materna disminuye la migración celular en los cultivos de explantes.

Cuantificación del crecimiento de los explantes como la distancia neta hacia el exterior migrada por las células en el margen de cada explante entre las horas 6 y 26 después del inicio del cultivo. Los asteriscos marcan la significación estadística en una prueba t (p < 0,05). (a) Los explantes de tejido posterior de embriones NOD expuestos a diabetes (exp., naranja) muestran un crecimiento significativamente reducido en comparación con los explantes de embarazos normales (n, blancos) en E7.5 (normal n = 10, expuestos n = 7; p = 1,7 × 10−3; 96,7 % de potencia en alfa = 0,05) y E8,5 (normal n = 8, expuesto n = 39; p = 6,7 × 10−4; 99,7 % de potencia en alfa = 0,05). (b) Los explantes de protuberancias diseccionadas (rojo) produjeron una excrecencia significativamente menor que el tejido posterior correspondiente (naranja) del mismo embrión (n = 12 pares; p = 6,2 × 10−5; 99,9 % de potencia en alfa = 0,05) en E8 .5. Tenga en cuenta la diferencia en la escala del eje Y. (c) Los explantes de tejido posterior de embriones E8.5 NOD expuestos a diabetes (naranja; mismos datos que en (a); n = 39) muestran un crecimiento reducido en comparación con los explantes de embriones FVB expuestos a diabetes en E8.5 (púrpura; n = 6; p = 4,4 × 10−7; 100 % de potencia en alfa = 0,05).

Estos resultados también demuestran que las condiciones de cultivo, incluida la matriz extracelular de apoyo y los factores de crecimiento presentes en el suero fetal de ternera, no son suficientes para rescatar las deficiencias de migración celular durante las 26 horas de cultivo de los explantes. El cultivo a concentraciones de glucosa más bajas no tuvo efecto sobre el resultado (p = 0,23 para E7.5, p = 0,22 para E8.5). Por lo tanto, los cultivos de explantes confirman nuestra conclusión de que la exposición en el útero a la diabetes materna provoca una migración celular alterada y reduce la salida de la racha primitiva, que en los individuos más gravemente afectados crea protuberancias de la placa neural.

También se han informado protuberancias en 20 modelos genéticos que involucran pérdida de función para Cripto (Tdgf1), Eomes, Fgf8, Fgfr1, Lrp5/Lrp6, Map4k4 (Nik), Mesp1/Mesp2, Mixl1, Pten, Rac1, Ship2, T , Talin y genes Tcf333,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49, o mutaciones inducidas por ENU en Axin2, Nckap1 (Nap1 ), Supt20 (p38IP) y genes Udgh50,51,52,53 (revisado en54). La migración deteriorada del mesodermo se implicó como base mecánica para tales acumulaciones de células y la ablación específica del epiblasto de Pten43 y Rac145 identificó esos genes como reguladores autónomos de la migración del mesodermo. Entre 15 mutantes de protrusión en los que los embriones sobreviven hasta etapas posteriores de desarrollo, los resultados comunes son tubo neural abierto o espina bífida (6 modelos), desarrollo cardíaco defectuoso (9 modelos) y defectos de crecimiento caudal (9 modelos)54. En contraste con los modelos de pérdida de función en los que se abolió la expresión, detectamos la expresión de todos estos genes en embriones expuestos a diabetes, con Axin2, Fgf8, Mesp1, Mesp2, Mixl1 y T particularmente prevalentes en las protuberancias (Fig. 2a y suplemento). Tabla 2), lo que indica que la migración defectuosa en nuestros modelos de exposición no se debe a la pérdida de la expresión del gen mesodérmico.

Curiosamente, las protuberancias se formaron en ubicaciones anteroposteriores discretas en lugar de a lo largo de toda la racha primitiva. De acuerdo con datos anteriores55, encontramos que dos tercios de los defectos del tubo neural en embriones NOD (~26 % de todos los embriones) involucran la región del tronco del embrión; esta tasa es comparable a una incidencia de protrusión del 25%, de las cuales casi todas aparecen en el territorio cubierto por la estría primitiva. En el modelo FVB, la mitad de los defectos del tubo neural (~11 % de todos los embriones) involucran el tronco (observaciones no publicadas), una tasa que nuevamente es paralela a la incidencia de protrusión (12,9 %). Por lo tanto, en ambos modelos de diabetes, la migración defectuosa del mesodermo puede explicar la gran mayoría de los defectos del tronco y del tubo neural caudal en embarazos diabéticos de ratón. Las protuberancias en ubicaciones más anteriores se detectaron solo ocasionalmente (p. ej., Fig. 1F e inserto). Incluso dentro del territorio primitivo de la raya, las protuberancias se limitaron a ubicaciones únicas, posiblemente indicativas de una ventana de tiempo limitada para las perturbaciones que contribuyen a la formación de protuberancias.

Hay tres posibilidades de cómo las protuberancias pueden causar defectos del tubo neural: (i) impidiendo la formación del punto de bisagra medial que se requiere para la flexión inicial de la placa neural56,57, (ii) comprometiendo la elevación y la flexión del futuro neuroepitelio57 debido a la disminución la migración celular al mesodermo subyacente y (iii) al interferir físicamente con el cierre del tubo neural en la línea media dorsal. Dado que estas alternativas no son mutuamente excluyentes, requieren mayor investigación. Exámenes minuciosos y análisis histológicos de embriones con protuberancias (Fig. 7) revelaron tubos neurales correctamente cerrados rostrales a la protuberancia, con falla de neurulación caudal a la protuberancia, lo que indica que en estos casos las protuberancias interfirieron físicamente con el cierre del tubo neural.

Efecto de las protuberancias en el cierre del tubo neural.

(a) Embrión a los 9,5 días de gestación (y primer plano) que muestra una protuberancia que emerge por debajo del techo dorsal del tubo neural, lo que impide el cierre hacia el extremo caudal del embrión. Un dibujo esquemático y un análisis histológico se muestran en la Figura complementaria 4. (b) Embrión en E9.5 con una protuberancia larga que emerge aproximadamente al nivel de la yema de la extremidad trasera, lo que hace que la placa neural se abra caudal a la protuberancia. (c) Embrión en E9.5 con una protuberancia bifurcada (los triángulos rosados señalan las extensiones de la protuberancia) que emana del tubo neural al nivel de la yema de la extremidad trasera, lo que hace que el tubo neural se abra caudalmente al punto de emergencia. El dibujo esquemático y el análisis histológico se proporcionan en la Figura complementaria 4. ( d ) Embrión en E10.5 (vista lateral y dorsal) con el prosencéfalo y el mesencéfalo cerrados, mientras que la neurulación falló caudal a la unión entre el mesencéfalo y el rombencéfalo. Se puede ver una pequeña protuberancia (línea negra punteada) cerca de la unión entre el rombencéfalo y la médula espinal. (e) Embrión en E10.5 con una protuberancia muy pequeña al nivel de la yema de la extremidad anterior. La neurulación se completó con éxito a lo largo del neuroeje excepto por la pequeña área de la protuberancia. (f) Embrión en E10.5 con una protuberancia más grande ligeramente caudal a la yema de la extremidad anterior (triángulo abierto). El tubo neural se cierra rostralmente a la protuberancia, mientras que permanece abierto (triángulo relleno de blanco) caudalmente desde la protuberancia hasta el final del neuroeje.

En este trabajo, hemos identificado la migración deteriorada del mesodermo como la falla morfogenética que subyace a la patogénesis de los defectos del tubo neural. Dado que estos defectos del tubo neural son causados por un factor de riesgo ambiental, la enfermedad metabólica materna, nuestros hallazgos implican que la migración del mesodermo es sensible al estado metabólico. La migración del mesodermo también parece responder a la composición de la dieta materna, ya que demostramos anteriormente que la dieta modula la tasa de defectos del tubo neural en el modelo FVB19. En la cepa NOD, la incidencia de defectos del tubo neural se reduce mediante la suplementación con ácido folínico, como se muestra arriba, similar a los efectos beneficiosos del ácido fólico en embarazos de ratones diabéticos inducidos por STZ58. Estos hallazgos respaldan la conclusión de que los factores metabólicos pueden afectar la formación y migración del mesodermo y, junto con los resultados de nuestros análisis moleculares, identifican nuevos objetivos celulares y moleculares para la prevención del tubo neural y otros defectos congénitos.

Las malformaciones congénitas más características en los embarazos diabéticos humanos son los defectos cardíacos, los defectos del tubo neural y los defectos del crecimiento caudal7,8,9,10 y se ha postulado que surgen antes de la semana 7 de embarazo7. Nuestros resultados respaldan la proposición de que la migración perturbada del mesodermo durante la gastrulación es la etiología común de estos defectos congénitos aparentemente heterogéneos59,60: (i) los defectos del tubo neural surgen como consecuencia de la migración alterada del mesodermo, como se demuestra aquí; (ii) los progenitores cardíacos tempranos se originan y migran a partir de la racha primitiva61,62; y (iii) los defectos de crecimiento caudal también son consistentes con la formación alterada del mesodermo y la migración63,64 en la línea primitiva posterior. De manera similar, se cree que las deficiencias mesodérmicas son la base de las malformaciones vertebrales, cardíacas, renales y de las extremidades de VACTERL65 y los fenotipos de displasia mesodérmica axial66, que se han relacionado con la diabetes materna67,68,69,70. Por lo tanto, nuestro descubrimiento de la migración aberrante del mesodermo durante la gastrulación en dos modelos diferentes de ratones con diabetes tipo I proporciona un mecanismo celular unificador que puede explicar tanto el momento del desarrollo como el origen morfogenético de las anomalías estructurales más comunes en la embriopatía diabética.

Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación previa del Centro de Investigación Biomédica de Pennington IACUC y de acuerdo con la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Los embriones se prepararon a los 8,5 días de gestación para el análisis histológico o molecular de madres NOD o FVB hiperglucémicas, así como de madres control normoglucémicas de la misma cepa. Los embriones con malformaciones se fijaron, se tiñeron con DAPI y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal de 2 fotones. Se usaron secciones ópticas para generar reconstrucciones tridimensionales de embriones individuales usando el software Imaris. Para determinar la etiología y la identidad del tejido saliente, realizamos un perfil de expresión génica mediante secuenciación de etiquetas de expresión en un secuenciador AB SOLiD 5500XL; Los perfiles de expresión se compararon entre el tejido saliente y la placa neural abierta preparada por microdisección láser inmediatamente anterior al sitio de cierre del tubo neural 1. Se mapearon las lecturas de secuencia (RefSeq RNA, mm9) usando SOLiDSAGE para generar datos de conteo para cada gen. La expresión génica diferencial se determinó mediante DESeq, con validación de genes seleccionados mediante qPCR. Se realizaron hibridaciones in situ y análisis inmunohistoquímicos en criosecciones siguiendo los protocolos establecidos. La capacidad migratoria de las células en las protuberancias y el tejido embrionario posterior se evaluó en cultivo de explantes, utilizando video de lapso de tiempo y microscopía de contraste de fase.

Códigos de acceso: los resultados de SAGE se han depositado en la base de datos Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE53075.

Cómo citar este artículo: Salbaum, JM et al. Modo novedoso de cierre defectuoso del tubo neural en la cepa de ratón diabético no obeso (NOD). ciencia Rep. 5, 16917; doi: 10.1038/srep16917 (2015).

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41598-022-09478-1

Wallingford, JB, Niswander, LA, Shaw, GM y Finnell, RH El desafío continuo de comprender, prevenir y tratar los defectos del tubo neural. Ciencia 339, 1222002, doi: 10.1126/ciencia.1222002 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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La secuenciación del ADN fue realizada por la Instalación central de genómica del Centro de investigación biomédica de Pennington y la Microscopía confocal, la Imagen en tiempo real y la Microdisección de captura láser se realizaron en la Instalación central de Biología celular y Bioimagen. Ambas instalaciones principales cuentan con el apoyo del Centro de Investigación de Nutrición y Obesidad de PBRC (NORC NIH-P30DK072476) y el Centro de Excelencia en Investigación Biomédica de PBRC (COBRE NIH-P20GM103528). Se agradece la asistencia técnica experta de Richard Carmouche, Susan Newman y Diana Holmes. Este proyecto fue financiado a través de subvenciones NIH R01-HD085017 y R01-HD055528, incluido el Suplemento HD055528-03S1 (para JMS) y R01-HD37804, incluido el Suplemento HD37804-S2 (para CK).

Departamento de Regulación de la Expresión Génica, Centro de Investigación Biomédica de Pennington, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, EE. UU.

J. Michael Salbaum y Jacalyn MacGowan

Centro de Investigación Biomédica Pennington Departamento de Biología del Desarrollo, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, EE. UU.

Claudia Kruger, Nils J. Herion y Claudia Kappen

Centro de investigación biomédica de Pennington Instalación central de biología celular y bioimagen, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, 70808, LA, EE. UU.

david burk

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JMS y JM realizaron disecciones de embriones, JM realizó disecciones con láser, C.Kr. preparó RNA, produjo las bibliotecas SAGE y realizó RT-PCR e hibridación in situ y experimentos de tinción histológica, con la asistencia de NH; DB realizó las imágenes y reconstrucciones confocales, JMS realizó los análisis SAGE y los cultivos de explantes, que fueron cuantificados por CK; CK y JMS diseñaron experimentos, coordinaron el proyecto, realizaron análisis bioinformáticos y escribieron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Salbaum, J., Kruger, C., MacGowan, J. et al. Modo novedoso de cierre defectuoso del tubo neural en la cepa de ratón diabético no obeso (NOD). Informe científico 5, 16917 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16917

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Recibido: 13 julio 2015

Aceptado: 21 de octubre de 2015

Publicado: 23 noviembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16917

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